一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法技术

本发明专利技术公开了一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，采用的技术方案是：将尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。本发明专利技术的相对定量方法具有通量高、灵敏度高、重现性好等特点。

【技术实现步骤摘要】
一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法
本专利技术属于蛋白质组学的
，具体涉及一种采用蛋白质组学测定急性肾损伤患者尿液中生物标志物的方法。
技术介绍
急性肾损伤(acutekidneyinjury，AKI)是指病程在3个月以内的肾脏结构与功能的异常(包括血、尿、组织学及影像学检查异常)，它以肾小球滤过率迅速下降为特征，是由不同病因导致的、具有不同临床表现的临床综合征。随着人口的老龄化，糖尿病、心血管疾病、造影剂肾病发病率的增加，近年来AKI的发生率明显增加。尽管对AKI的认识不断深入，支持和辅助的治疗措施也有不断进展，但AKI的预后仍差，死亡率居高不下。改善AKI预后的关键是早期诊断，早期干预。目前AKI的诊断标准为：肾功能在48h内突然减退，表现为至少两次血清肌酐升高的绝对值≥26.5μmol/L；或血清肌酐较基础值升高≥50％；或尿量<0.5ml/(kg·h)，时间超过6h(排除梗阻性肾病或脱水状态)。由此可见，目前对AKI的诊断仍基于血清肌酐和尿量的测定，但它们并不能在早期反映肾小球滤过率(glomerularfiltrationrate,GFR)的下降，且受到众多外在因素的影响。因此以肌酐测定为基础的肾功能评价体系阻碍了AKI治疗的进展，需要用更加敏感、特异的方法测定肾功能的下降。理想的AKI生物标志物最好具备如下特点：(1)检测标本容易获得，无创，易于在床边或临床标准实验室进行，快速、方便、测定费用低廉；(2)对AKI高度敏感，能早期发现和诊断AKI；(3)具有较宽的动态范围和诊断阈值，便于统计学分析；(4)能鉴别损伤部位(近端肾小管、远端肾小管、肾间质或肾血管)；(5)能评价肾脏损伤的持续时间(AKI、慢性肾脏病或慢性肾衰急性加重)；(6)能鉴别AKI的病因(缺血、中毒、混合型)；(7)能定义AKI的病程以及监测对AKI干预的临床效果；(8)在探索新药治疗AKI方面发挥关键作用。近年来，随着功能性基因组学和蛋白质组学的发展，研究人员从血液或尿液样本中逐渐筛选出一些有临床应用前景的AKI新型生物标志物，这些新的标志物不仅能在血清肌酐升高之前诊断AKI，而且能为AKI的病因诊断提供帮助。2014年由AzraBihorac和LakhmirSChawla等于AmJRespCritCare杂志上最新发表的文献《Validationofcell-cyclearrestbiomarkersforacutekidneyinjuryusingclinicaladjudication》报道确定了急性肾损伤的两个新标志物。同时，该研究小组验证了这两个新的标志物：尿中的金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)，当用这两个指标一起评估时，就能便于临床医生在现行标准指示疾病发生之前检测和治疗AKI。目前，关于金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)的准确定量检测手段并没有完整和确定的方法，因此，为了让这两个指标能够尽早的应用于诊断，辅助临床医生对急性肾损伤的诊断，需要开发一种方法对这两种物质进行准确的定量，为后续的研究和临床应用提供一种检测方法。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是，建立一种可以同时测定尿液样本中金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)和胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)生物质谱相对定量方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，分别将病人组和正常组的尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。进一步地，所述尿液样本酶解得到多肽片段溶液的步骤包括：样本干燥与复溶、蛋白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐。进一步地，所述样本干燥与复溶方法为：收集正常人和急性肾损伤病人的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水进行复溶。进一步地，所述蛋白提取与复溶定量方法为：将复溶的尿液样本用3-5倍体积的丙酮进行蛋白沉淀，将丙酮沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到蛋白溶液，然后用Bradford方法初步定量样本中蛋白的含量。进一步地，所述样本酶切方法为：向定量后的蛋白溶液中加入400uL50mM的碳酸氢铵溶液，再加入20uL0.5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37℃孵育12-16小时，得到多肽片段溶液。进一步地，所述样本脱盐方法为：首先用100％甲醇平衡C18柱1min，然后将酶切得到的多肽片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次，然后用80％的乙腈溶液洗脱C18柱，收集洗脱流出液，得到多肽片段溶液。进一步地，所述液相色谱-串联质谱分析中，液相色谱条件为：色谱柱：peptideC18柱，50mm×2.1mmI.D.，5um粒径；流动相：甲酸体积百分数占0.1％的水和甲酸体积百分数占0.1％的乙腈，梯度洗脱；柱温40℃；流速500μl/min；进样量20uL；所述的梯度洗脱程序如下表所示：时间(min)流速(μl/min)％A％B0.35009553050060404550020801850020805150095560500955其中A是甲酸体积百分数占0.1％的水溶液，B是甲酸体积百分数占0.1％的乙腈混合溶液；质谱条件为：四级杆飞行时间液相色谱-串联质谱仪，配有电喷雾离子化源和数据处理软件；离子源：电喷雾离子化源；正离子方式检测；离子喷射电压23000V；温度500℃；源内气体1：氮气压力15psi；源内气体2：氮气压力0psi；气帘气体：氮气压力30psi；扫描方式为多重反应监测。进一步地，所述的生物信息分析方法为：用ProteinPilot做数据检索，同时用skyline做非标记定量，根据数据检索和分析的结果计算出样本中金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对含量。本专利技术提供的一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，具有的优势在于：1、对正常和疾病状态的样本可同时进行分析和定量，具有通量高、灵敏度高、重现性好等特点。2、尿液样品经过干燥和复溶处理可以使样本得以浓缩，提高样本中的蛋白浓度，便于后续的蛋白提取，同时减弱了样品测定过程中基质干扰，使得测定结果更准确且定量下限降低。3、蛋白溶液经过酶解和脱盐处理，减少了盐分对质谱分析仪的污染，有利于仪器的维护，同时测定的结果也更加可靠。4、本专利技术所用试剂及药品均采用现有的常规市售试剂或常规市售试剂的组合，且配制方法简单，利于方法推广。5、本专利技术的样品处理过程和定量方法简单易行，对尿液中其他蛋白含量的检测有一定的借鉴意义，可用于其他疾病尿液诊断标志物的检测及疾病与对应诊断标志物的关联性研究。附图说明图1为本专利技术实施例提供的(TIMP)-2和IGFBP7所包含的肽段的比值。其中P16035是金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2在uniprot数据库里的编码，对应的图显示的是病人和正常对照组尿液样本中金属蛋白酶组织抑制物(TIMP)-2所包含的肽段的比值；其中Q16270是胰岛素样生长因子结合蛋白7(IGFBP7)在uniprot数据库里本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，其特征在于：分别将病人组和正常组的尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱‑串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量。

【技术特征摘要】
1.一种尿液中急性肾损伤生物标志物质谱相对定量方法，其特征在于：分别将病人组和正常组的尿液样本酶解得到多肽片段溶液，用液相色谱-串联质谱分析多肽片段溶液，然后利用生物信息学的方法对数据进行分析，实现对金属蛋白酶组织抑制物和胰岛素样生长因子结合蛋白7的相对定量；所述尿液样本酶解得到多肽片段溶液的步骤包括：样本干燥与复溶、蛋白提取与复溶定量、样本酶切和样本脱盐；所述样本干燥与复溶方法为：收集正常人和急性肾损伤病人的尿液样本进行真空冷冻干燥处理，将冷冻干燥得到的尿液样本用超纯水进行复溶；所述蛋白提取与复溶定量方法为：将复溶的尿液样本用3-5倍体积的丙酮进行蛋白沉淀，将丙酮沉淀得到的蛋白用超纯水复溶，得到蛋白溶液，然后用Bradford方法初步定量样本中蛋白的含量；所述样本酶切方法为：向定量后的蛋白溶液中加入400uL50mM的碳酸氢铵溶液，再加入20uL0.5mg/mL的胰酶溶液，混匀，于37℃孵育12-16小时，得到多肽片段溶液；所述样本脱盐方法为：首先用100％甲醇平衡C18柱1min，然后将酶切得到的多肽片段溶液注入C18柱中，用超纯水洗脱C18柱2次，然后用80％的乙腈溶液洗脱C18柱，收集洗脱流出液，得到多肽片段溶液；所述液相色谱-串联质谱分析中，液相色谱条件为：色谱柱：peptideC18柱...

【专利技术属性】
技术研发人员：华权高，沈鹤霄，
申请(专利权)人：武汉华美生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42