一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。该方法包括以下步骤：１）将裸子植物花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中，于－２０～－４℃下放置；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于丙酮中，－２０℃放置２－１６小时，离心后收集沉淀，再用８０％丙酮溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；２）将步骤１）得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。本发明专利技术的分离制备裸子植物花粉管全蛋白用于双向电泳的方法快速、简单易行，可获得较高质量而且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种制备裸子植物花粉管全蛋白的方法，特别涉及。
技术介绍
花粉管作为有花植物受精过程中雄性生殖单位的载体，具有典型的极性生长特征，因而是研究细胞形态建成、囊泡及细胞器运动以及信号转导途径的理想模式体系。蛋白质组分析是研究花粉管中蛋白质对细胞自身变化及环境刺激响应的重要技术手段，有利于深入了解高等植物有性生殖过程以及细胞极性生长机理。选择合适的样品制备方法是决定蛋白质组研究成败的关键步骤。细胞必须进行有效的破碎，同时还要去除杂质并尽量避免蛋白样品的降解。裸子植物花粉管中富含多糖、脂类、核酸等干扰双向电泳过程的杂质。迄今为止还没有制备裸子植物花粉管全蛋白样品用于双向电泳的有效方法和技术，从而导致与裸子植物相关的蛋白质组研究相对被子植物而言比较滞后。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种制备较高质量的裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法。本专利技术所提供的制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤1)将裸子植物花粉管粉末悬浮于0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液中，于-20--4℃下放置1-2小时；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20--4℃放置2-16小时，离心后收集沉淀，再用含有体积百分含量为0.05-0.07％的巯基乙醇和体积百分含量为70-80％的丙酮溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；2)将步骤1)得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有5～7mol/L尿素(urea)，1-2mol/L硫脲(thiorea)，0.01-0.02g/mL CHAPS(3-propanesulfonic acid)，体积百分含量为1-2％、pH为3.5-10的两性电解质、质量百分含量为0.6-1％的二硫苏糖醇(DTT)、25-50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。所述裸子植物花粉管粉末可通过在液氮中研磨获得。所述0.1-0.125g/mL三氯乙酸溶液用含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液配制。所述三氯乙酸溶液中三氯乙酸的浓度优选为0.125g/mL。所述步骤1)中花粉管粉末悬浮于三氯乙酸溶液中于-20℃下放置2小时。所述步骤1)中含有体积百分含量为0.05-0.07％巯基乙醇的丙酮溶液重悬沉淀后，于-20℃放置2-16小时。为了获得更好的提取和分离效果，所述裂解缓冲液优选为含有7mol/L尿素(urea)、2mol/L硫脲(thiorea)、0.02g/ml CHAPS、体积百分含量为2％的两性电解质、质量百分含量为1％的二硫苏糖醇(DTT)、50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。所述步骤2)中，全蛋白粗提物与裂解缓冲液的质量体积比可为120mg/400μL-150mg/400μL裂解缓冲液，优选为150mg/400μL裂解缓冲液。为了使尽可能多的蛋白溶解于裂解缓冲液中，可将加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液27-37℃下水浴15-30min，然后在室温下于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，15000-17000g收集上清液，即为裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液。所述加入全蛋白粗提物的裂解缓冲液的水浴温度优选为27-29℃，水浴时间优选为30min。上述方法中的离心条件均为在4℃15000rpm(19117g)离心10min。所述裸子植物可为白皮松、红松、油松、云杉、冷杉等松杉纲、银杏等银杏纲以及苏铁纲的裸子植物；优选为松杉纲，尤其优选为松科裸子植物，特别优选为白杆或白皮松。本专利技术的方法采用三氯乙酸和丙酮有效的去除裸子植物花粉管中的多糖、脂类和核酸等干扰双向电泳的杂质。本专利技术的方法裂解缓冲液中的尿素可以使蛋白质去折叠暴露疏水核心，而配合使用硫脲会增加蛋白质在固定pH梯度(IPGs)胶条中的溶解性，二硫苏糖醇还原二硫键从而使蛋白质达到完全溶解的状态，载体两性电解质能清除氰酸盐离子、离心时加速核酸沉淀，而PMSF则能够有效的防止样品制备过程中蛋白的降解。本专利技术的制备裸子植物花粉管全蛋白样品的方法快速、简单易行，可获得较高质量的重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。附图说明图1为白杆花粉管全蛋白样品双向电泳图谱图2为白皮松花粉管全蛋白样品双向电泳图谱具体实施方式下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的浓度，如无特别说明，均为体积百分比(V/V)。实施例1、制备白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液并进行双向电泳分析1)过滤收集用液体培养基(0.0001g/mL硼酸，0.0003g/mL硝酸钙，0.12g/mL蔗糖)培养白杆花粉粒22小时得到的花粉管，液氮快速研磨成粉末；2)将步骤1)得到的粉末悬浮于含有0.125g/ml三氯乙酸和0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，于-20℃下放置2小时；3)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于三倍体积的-20℃预冷过的含0.07％的巯基乙醇的丙酮溶液中，-20℃放置16小时；4)4℃15000rpm(19117g)离心10min，弃除上清液，将沉淀重悬于含0.07％的巯基乙醇和80％丙酮的溶液中，-20℃放置1h；5)离心弃除上清液，得到沉淀，再重复步骤4)1-2次。待丙酮挥发完后，得到全蛋白粗提物干粉，用裂解缓冲液按照400μL/150mg干粉的量溶解全蛋白粗提物干粉，29℃水浴半小时后，室温于60-150rpm(旋转半径为25mm)的摇床上振荡1小时，使全蛋白粗提物干粉充分溶解，之后17000g室温离心取上清，即为白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液；裂解缓冲液是含有7mol/L尿素(urea)、2mol/L硫脲(thiorea)、0.02g/ml CHAPS、2％两性电解质(ampholine pH3.5-10)、质量百分比为1％的二硫苏糖醇(DTT)和50μg/mL苯甲基磺酰氟(PMSF)的溶液。6)通过上述过程提取的蛋白质，用Bradford法紫外分光光度计测定蛋白浓度，结果表明上述得到的白杆花粉管全蛋白双向电泳样品液中蛋白浓度为4-6μg/μL。按照如下方法进行双向电泳利用EttanTMIPGphor IITMIsoelectric FocusingSystem(通用电气医疗集团，USA)在20℃进行第一向等电聚焦电泳。电泳条件为500V电泳1h，随后1000V电泳1h，最后8000V电泳8.3h，总伏时数达到64000V×h。然后将聚焦后的固定pH梯度胶条在10mL平衡缓冲液1(50mmol/LTris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.01g/mL二硫苏糖醇)中平衡15min，然后在10mL平衡缓冲液2(50mmol/L Tris-Cl缓冲液，pH8.8；6mol/L urea；30％甘油，0.02g/mL SDS，0.25g/mL碘乙酰胺)中平衡30min。将平衡后的胶条转移到第二向凝胶上。第二向电泳利用Ettan DALTsixsystem(通用电气医疗集团，USA)在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品的方法，包括以下步骤：１）将裸子植物花粉管粉末悬浮于０．１－０．１２５ｇ／ｍＬ三氯乙酸溶液中，于－２０－－４℃下放置１－２小时；离心后收集沉淀，将该沉淀重悬于含有体积百分含量为０．０５－０．０７％的巯基乙醇的丙酮溶液中，－２０－－４℃放置２－１６小时，离心后收集沉淀，再用含有体积百分含量为０．０５－０．０７％的巯基乙醇和体积百分含量为７０－８０％的丙酮的溶液洗涤，除去丙酮后得到裸子植物花粉管全蛋白粗提物；２）将步骤１）得到的裸子植物花粉管全蛋白粗提物溶解于裂解缓冲液后，离心取上清得到裸子植物花粉管全蛋白双向电泳样品液；所述裂解缓冲液为含有５－７ｍｏｌ／Ｌ尿素，１－２ｍｏｌ／Ｌ硫脲，０．０１－０．０２ｇ／ｍＬＣＨＡＰＳ，体积百分含量为１－２％、ｐＨ为３．５－１０的两性电解质、质量百分含量为０．６－１％的二硫苏糖醇、２５－５０μｇ／ｍＬ苯甲基磺酰氟的溶液。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：林金星，陈彤，吴小琴，陈艳梅，汪小雄，
申请(专利权)人：中国科学院植物研究所，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]