适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法技术

本发明专利技术公开了一种适合双向电泳的马尾松针叶总蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物（如色素、酚类、醌类等）成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析。本发明专利技术采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，该方法重复性和稳定性好，是良好的适用于针叶类植物总蛋白提取的分析的方法。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了一种适合双向电泳的马尾松针叶总蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物（如色素、酚类、醌类等）成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析。本专利技术采用的双向电泳分析方法分离得到的蛋白点多，经PDQuest图像分析软件检测，蛋白点多于1000个，且图谱清晰，无横向、纵向条纹，该方法重复性和稳定性好，是良好的适用于针叶类植物总蛋白提取的分析的方法。【专利说明】
本专利技术属于生物
，涉及一种。
技术介绍
马尾松(Pinus massoniana),属于松科松亚属针叶树种，是我国南方重要的脂材两用树种，它用途广泛、经济价值高，是我国林浆纸(板)、松脂和建筑等行业的主要原料树种。其生长迅速，生产力高，适应性强，遍布于华中华南各地。但近年来，由于氮氧化物的过度排放，导致大气污染严重。这些物质在大气中氧化并随降水返回地面形成酸沉降导致马尾松冠层针叶脱落，从而进一步给马尾松林带来严重破坏。为了弄清酸性沉降危害马尾松的破坏机理，需要提取其针叶中的蛋白分析酸性沉降对其针叶细胞蛋白表达变化的影响情况。而作为高大乔木类树种，其针叶中含有大量核酸、多糖、多酚等次生代谢干扰物质，应用文献报道的蛋白提取方法不能有效的去除这些物质。
技术实现思路
本专利技术的目的是:提供一种，建立适用于马尾松蛋白质组分有效分离、分析的方法，能对马尾松针叶的总蛋白质进行分离，该方法为马尾松植物及其他松柏科裸子植物材料蛋白质组学研究提供实验基础和参考。本专利技术的技术解决方案是:首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物(如色素、酚类、醌类等)成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析；该提取方法具体包括以下步骤: (1)采集马尾松针叶，用超纯水洗净，并用滤纸吸去叶面水分，迅速放入液氮中速冻，并移至-80°c冰箱保存备用； (2)称取2g上述步骤保存的马尾松叶片迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中按1:2的质量体积比加入提取缓冲液、0.2g聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成匀浆液；所用提取缓冲液组成为:20 mM (m mol/L) Tris-HCl (pH 7.5),250 mM蔗糖，10mM EDTA, I mM苯甲基磺酰氟(PMSF，使用前加入)，0.07% 二硫叔糖醇DTT (使用前加入)，I% v/v Triton X-100 ； (3)研磨后的匀浆液装入50ml_20°C预冷离心管中，加入同体积的ρΗ7.5的Tris-HCl饱和酹(酹提取蛋白)，放入振荡器中振荡15-30 min后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min ,取酹相；(4)步骤(3)酚相中加入3倍体积的醋酸铵(溶剂为甲醇)，放入_20°C冰箱沉淀过夜； (5)步骤(4)的过夜物-4°C低温离心机15000rpm离心15min,取沉淀； (6)洗涤步骤(5)沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮(均在-20°C冰箱预冷使用，含有质量体积比为0.07%的二硫苏糖醇(DTT))，每次洗完后，_4°C低温离心机15000rpm离心15min，获得沉淀，将蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪真空冷冻干燥，得到马尾松针叶全蛋白粉末，备用； (7)步骤(6)蛋白干粉在4°C按mg蛋白400μ L裂解液的质量体积比加入裂解液裂解样品，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶10分钟，-4°C 15000 rpm离心30 min去除沉淀，得到蛋白质提取液，取上清液测量样品蛋白浓度；采用考马斯亮兰法(Bradford)测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量；现用现配的裂解液由如下试剂构成-J M尿素，2 M硫脲，4% w/V 3--1-丙磺酸(CHAPS)，2% v/v两性电解质所用的载体两性电解质为 carrier ampholytes, GE), 1% w/v DTT (使用前加入),0.5% v/v IPG 缓冲液，溶剂为水； (8)取步骤(7)的蛋白质提取液进行第一向等电聚焦电泳:按上样量500yg，上样体积450μ1，用水化液对已定量好的蛋白样品进行稀释；将蛋白样品加入水化盘内后，再将线性 IPG 胶条(pH 4-7,17cm, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA)胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用IOml矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦；等电聚焦的参数设置如下:30伏水化，10小时；200伏(升压模式为step-n-hold), I小时；500伏(升压模式为step-n-hold), I小时；1000伏(升压模式为st印-n-hold)，l小时；8000伏(升压模式为gradiet)，4小时；8000伏(升压模式为step-n-hold),60000Vh ；500 伏(升压模式为 step-n-hold,保持)； (9)胶条平衡处理:将步骤(8)等电聚焦完成后的IPG胶条进行平衡2次，第一次胶条平衡缓冲液为:每Iml胶条平衡缓冲液母液加入IOmg 二硫苏糖醇(DTT);第二次胶条平衡缓冲液为:每Iml胶条平衡缓冲液母液加入25mg碘乙酰胺；每次平衡时间为15min ；二次平衡缓冲液配制如下:胶条平衡缓冲液母液:6mol/L的尿素，质量体积比2.5%的十二烷基磺酸钠(SDS)，50 mmol/L的Tris-HCl (pH为6.8)，体积比30%的甘油，溶剂为水； (10)第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳:将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶(15%分离胶，4%浓缩胶)的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封(避免产生气泡)，加入电极缓冲液(含0.001%溴酚蓝显色剂)进行SDS - PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源； (11)电泳结束后对胶条采用考马斯亮蓝(CBBR-250)染色法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测:电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30 min;固定好的凝胶置于CBB R-250染色液中，室温下染色3小时以上；倒出染色液,加入脱色液进行脱色；15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行；固定液配方:40% v/v乙醇，10% v/v冰乙酸，溶剂为水；染色液考马斯亮蓝CBB R-250配方:0.116% w/v考马斯亮蓝(CBB)R-250，25% v/v乙醇，8% v/v冰乙酸，溶剂为水；脱色液配方:25% v/v乙醇，8% v/V冰乙酸，溶剂为水。本专利技术具有以下优点: 1、在马尾松针叶总蛋白提取过程中，本专利技术经过大量实验研究，对提取缓冲液、样品洗涤液和裂解液的组成及配比进行大量筛选，以叶片总蛋白的提取率和总蛋白中各蛋白的提取完整性为指标进行筛选，优化得到最佳配比的提取缓冲液、样品洗涤液和裂解液，采用本专利技术提取缓冲液液、样品洗涤液和裂解液对马尾松针叶总蛋白的提取率高，且能保本文档来自技高网...

【技术保护点】
适合双向电泳的马尾松针叶蛋白质提取方法，首先将马尾松针叶蛋白质提取出来，然后采用双向电泳方法将蛋白质各成分和次生代谢物成分进行分离，最后采用考马斯亮蓝染色法进行定性分析和/ 或采用质谱仪对分离的蛋白质进行定性和定量分析；其特征在于包括以下具体步骤：(1) 采集马尾松针叶，用超纯水洗净，并用滤纸吸去叶面水分，迅速放入液氮中速冻，并移至‑80℃冰箱保存备用；(2) 称取2g上述步骤保存的马尾松叶片迅速放入冰浴的研钵中，加液氮研磨成细粉，研磨过程中按1：2 质量体积比加入提取缓冲液、0.2g 聚乙烯吡咯烷酮，在冰浴下研磨成匀浆液；（3）研磨后的匀浆液装入50ml ‑20℃预冷离心管中，加入同体积的pH7.5Tris‑HCl饱和酚（酚提取蛋白），放入振荡器入振荡15‑30 min后，‑4℃低温离心机15000rpm离心15min ，取酚相；（4）步骤（3）酚相中加入3倍体积的醋酸铵（溶剂为甲醇），放入‑20℃冰箱沉淀过夜；（5）步骤（4）过夜物‑4℃低温离心机15000rpm离心15min，取沉淀；（6）洗涤步骤（5）沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮（均在‑20℃冰箱预冷使用，含有质量体积比为0.07%的二硫苏糖醇（DTT）），每次洗完后，‑4℃低温离心机15000rpm离心15min，获得沉淀，将蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪真空冷冻干燥，得到马尾松针叶全蛋白粉末，备用；（7）步骤（6）蛋白干粉在4℃按每mg蛋白400μL裂解液的质量体积比加入裂解液裂解样品，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶后10分钟，‑4℃下15000 rpm离心30 min去除沉淀，得到蛋白质提取液，取上清测量样品蛋白浓度；采用考马斯亮兰法（Bradford）测定其蛋白浓度，对蛋白质进行定量； (8) 取步骤(7) 得到的蛋白质提取液进行第一向等电聚焦电泳：按上样量500μg，上样体积450μl，用水化液对已定量好的蛋白样品进行稀释；将蛋白样品加入水化盘内后，再将线性IPG 胶条（选pH 4‑7，17cm，GE Healthcare，Piscataway，NJ，USA）胶面向下放入水化盘中，除去胶面与蛋白样品液间的气泡，每个胶条用10ml 矿物油覆盖胶条，进行水化；水化结束后进行等电聚焦； (9) 胶条平衡处理：将步骤(8) 等电聚焦完成后的IPG 胶条进行平衡2 次，第一次胶条平衡缓冲液为：每1ml 胶条平衡缓冲液母液加入10mg 二硫苏糖醇(DTT) ；第二次胶条平衡缓冲液为：每1ml 胶条平衡缓冲液母液加入25mg 碘乙酰胺；每次平衡时间为15min；（10）第二向聚丙烯酰胺凝胶(SDS‑PAGE) 电泳：将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶（15%分离胶，4%浓缩胶）的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封，加入电极缓冲液（含0.001%溴酚蓝显色剂）进行SDS－PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源；（11）电泳结束后对胶条采用考马斯亮蓝（CBB R‑250）染色法进行染色分析或对蛋白质进行质谱检测：电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30 min；固定好的凝胶置于CBB R‑250染色液中，室温下染色3小时以上；倒出染色液，加入脱色液进行脱色；15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止；固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘廷武，徐建明，罗玉明，杨立明，杨文杰，
申请(专利权)人：淮阴师范学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32