本发明专利技术公开了一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法。该方法选取液氮法充分研磨组织，然后采用三氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白质，通过使用含有二硫苏糖醇和三氯乙酸的预冷丙酮溶液沉淀蛋白并用含有二硫苏糖醇的预冷丙酮溶液数次洗涤沉淀，最后通过加入样品裂解液制备出适合双向电泳的高质量的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。本发明专利技术制备出双向电泳样品的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且实验重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的生物质谱分析鉴定蛋白，具有较大的实际应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品的制备方法，特别涉及一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的样品制备方法。
技术介绍
我国自本世纪初开展克氏原螯虾人工养殖以来，其养殖规模逐年扩大，占地面积已超过了 300万亩，年产量超过50万吨，成为我国淡水虾类的重要新兴水产养殖资源。随着国内消费量和加工出口数量的增加，克氏原螯虾的野生资源数量明显减少，因此，提高人工养殖产量以满足市场的需求已成为广大养殖户及科技工作者为之奋斗的共同目标和重要课题。我国的克氏原螯虾虽然已形成了规模化生产，但是制约该虾产业化发展的技术瓶颈尚未得到有效的解决，其中比较突出的问题有克氏原螯虾规模化养殖的苗种配套技术问题、苗种繁育率问题、亲虾和虾苗放养成活率问题等等。开展克氏原螯虾卵巢发育机制的研究，不仅是解决上述瓶颈问题的有效途径，另一方面，对于该物种种质资源的保护及其品种的遗传改良等具有非常积极的意义。目前国内针对克氏原螯虾卵巢组织总蛋白作为研究对象的研究开展得较少，且主要是利用克隆技术对组织中单一性功能蛋白进行纯化及展开性质研究，通过类似方法无法达到全面获取克氏原螯虾卵巢组织发育分子构成，并研究其发育机制的目的。宏蛋白质组学是最近几年被提出的新概念，其定义是指对某一特定环境中个体(器官、组织、细胞等) 的所有蛋白质进行大规模的分析和鉴定。宏蛋白质组学的研究策略主要包括环境总蛋白的提取制备、蛋白质分离、以及蛋白质谱鉴定和数据分析等步骤。应用宏蛋白质组学理论和思想，利用双向电泳技术对克氏原螯虾卵巢组织所有可溶性蛋白进行高分辨率分离，能为后续通过质谱分析手段大规模鉴定发育相关基因，并进一步了解其基因性质奠定基础。选择合适的样品制备方法是双向电泳成功的关键因素之一，制备方法选择不当， 会造成大量盐离子和其它干扰物质残留，严重影响等电聚焦，从而影响双向电泳的结果。虾类卵巢组织中的所有可溶性蛋白必须尽可能地从组织中利用破碎、裂解、并适当的缓冲体系中提取出来，要在尽可能去除多糖、脂类、核酸等干扰性杂质的同时，尽量避免目标蛋白样品的降解和丢失。迄今为止，没还有适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的样品制备方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种可有效去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳效果的物质，能够更加彻底地去除上述杂质的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的处理方法，以得到更适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的样品的方法。本专利技术的技术方案，其特征是包括以下步骤(1)称取克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织500mg，放入预冷至0 _20°C的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15mL离心管中；(2)向步骤(1)中的15mL离心管中加入上述克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织4 6 倍体积的、冰水混合液中预冷至0°C的、以丙酮为溶剂的溶液A，充分混勻，于0 -20°c放置 2 4h，0 20°C、12000 15000r/min离心20 30min，收集所得沉淀物；所述以丙酮为溶剂的溶液A中的溶质为0. 01 0. 03mmol/L的二硫苏糖醇、体积浓度为15% 20%的三氯乙酸；(3)向步骤(2)所得沉淀物中加入2mL冰水混合液中预冷至0°C的以丙酮为溶剂的溶液B，充分混勻，于0 -20°C放置2 4h，0 _20°C、12000 15000r/min离心20 30min,收集所得沉淀物；用上述以丙酮为溶剂的溶液B重复清洗沉淀一次，于0 _20°C低温静置挥发残留丙酮3 证，得蛋白沉淀；所述以丙酮为溶剂的溶液B中的溶质为0. 01 0. 03mmol/L的二硫苏糖醇；(4)向步骤(3)中制得的蛋白沉淀中加入600 μ L的样品裂解液，室温下充分裂解 2 池，得蛋白质混合液；所述样品裂解液以体积百分含量0. 5% 1 %的IPG缓冲液为溶剂，其中含有6 8mol/L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、10 μ L/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0. 002g/mL的溴酚蓝；(5)将步骤(4)中蛋白混合液于4 6°C、12000 15000r/min离心20 30min, 收集上清液，即为适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。所述步骤O)以丙酮为溶剂的溶液A中二硫苏糖醇的含量为0. 02mmol/L，加入三氯乙酸至其终体积浓度为20%。所述步骤(3)中所述以丙酮为溶剂的溶液B中二硫苏糖醇的含量为0. 02mmol/L。所述步骤(4)中样品裂解液组成为8mol/L尿素、0. 02g/mL的CHAPS、10 μ L/mL的苯甲基磺酰氟PMSF和0. 002g/mL的溴酚蓝，溶剂为体积百分含量为0. 5%的IPG缓冲液。所述步骤(2)中以丙酮为溶剂的溶液A加入量为克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织体积的5倍。使用的样品裂解液中，尿素作为变性剂能够破坏蛋白质的高级结构，打断非共价连接。CHAPS是一种兼性去污剂，它能打断蛋白质分子或亚基间的疏水作用，增加蛋白质的溶解性。二硫苏糖醇可以打断二硫键，并使所有蛋白处于还原状态。PMSF是一种蛋白酶抑制剂，能有效抑制丝氨酸蛋白酶以及巯基蛋白酶的酶活，防止目标蛋白的降解。IPG缓冲液能通过电荷间的相互作用减少蛋白质结合，从而达到增加蛋白可溶性的目的。本专利技术的有益效果本专利技术采用三氯乙酸-丙酮法沉淀蛋白质，可以有效去除盐离子、多糖、脂类、核酸等干扰电泳效果的物质。同时，本专利技术在提取蛋白的过程中，增加了丙酮清洗的次数，从而能够更加彻底地去除上述杂质。本专利技术制备适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白的方法快速可靠、简单易行，可获得较高质量且重复性较好的双向电泳图谱，便于后续的质谱分析鉴定，具有较大的实际应用价值。附图说明图1为利用本专利技术制备的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品的双向电泳图谱。 具体实施例方式本专利技术中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有不能领域普通技术人员通常理解的含义。以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。应理解，以下实施例只是为了举例说明本专利技术，而非以任何形式限制本专利技术的范围。实施例11、克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备(1)称取发育期克氏原螯虾新鲜卵巢组织500mg，先放入_20°C预冷的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到15mL离心管中；(2)向步骤(1)离心管中加入5倍体积预冷的以丙酮为溶剂的溶液A(其中含有0. 02mmol/L的二硫苏糖醇、终体积浓度为20%的三氯乙酸)，充分混勻，于_20°C放置 2h, -20°C>12000r/min 离心 20min，收集沉淀；(3)向步骤⑵沉淀中加入2mL冰水混合液中预冷至0°C的以丙酮为溶剂的溶液 B (其中含有0. 02mmol/L的二硫苏糖醇)，充分混勻，于_20°C放置2h，-20°C、12000r/min离心20min，收集沉淀。采用预冷的以丙酮为溶剂的溶液B重复清洗沉淀一次，于_20°C低温静置挥发残留丙酮4h;(4)向步骤(3)中制得的蛋白沉淀中加入600μ L的样品裂解液(其中含有8mol/L 尿素、0. 02g/mL的CHAPSU0 μ L/mL的PMSF、体积百分含量为0. 5%的IPG缓冲液、0. 002g/ mL的溴酚蓝)，室温下充分裂解池；(5)将步骤(4)中蛋白混合液于4°本文档来自技高网...
【技术保护点】
１． 一种适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品制备方法，其特征是：包括以下步骤：（１）称取克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织５００ ｍｇ，放入预冷至０～－２０℃的研钵中剪碎，再用液氮充分研磨成粉末状，转移到１５ ｍＬ离心管中；（２）向步骤（１）中的１５ ｍＬ离心管中加入上述克氏原螯虾新鲜成熟卵巢组织４～６倍体积的、冰水混合液中预冷至０℃的、以丙酮为溶剂的溶液Ａ，充分混匀，于０～－２０℃放置２～４ｈ，０～２０℃、１２０００～１５０００ ｒ／ｍｉｎ离心２０～３０ｍｉｎ，收集所得沉淀物；所述以丙酮为溶剂的溶液Ａ中的溶质为：０．０１～０．０３ ｍｍｏｌ／Ｌ的二硫苏糖醇、体积浓度为１５％～２０％的三氯乙酸；（３）向步骤（２）所得沉淀物中加入２ ｍＬ 冰水混合液中预冷至０℃的以丙酮为溶剂的溶液Ｂ，充分混匀，于０～－２０℃放置２～４ｈ，０～－２０℃、１２０００～１５０００ ｒ／ｍｉｎ 离心２０～３０ ｍｉｎ，收集所得沉淀物；用上述以丙酮为溶剂的溶液Ｂ重复清洗沉淀一次，于０～－２０℃低温静置挥发残留丙酮３～５ ｈ，得蛋白沉淀；所述以丙酮为溶剂的溶液Ｂ中的溶质为：０．０１～０．０３ ｍｍｏｌ／Ｌ 的二硫苏糖醇；（４）向步骤（３）中制得的蛋白沉淀中加入６００ μＬ的样品裂解液，室温下充分裂解２～３ ｈ，得蛋白质混合液；所述样品裂解液以体积百分含量０．５％～１％的ＩＰＧ缓冲液为溶剂，其中含有６～８ ｍｏｌ／Ｌ尿素、０．０２ ｇ／ｍＬ的ＣＨＡＰＳ、１０ μＬ／ｍＬ的苯甲基磺酰氟ＰＭＳＦ和０．００２ ｇ／ｍＬ的溴酚蓝；（５）将步骤（４）中蛋白混合液于４～６℃、１２０００～１５０００ｒ／ｍｉｎ 离心２０～３０ ｍｉｎ，收集上清液，即为适合双向电泳的克氏原螯虾卵巢组织总蛋白样品。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：水燕，周鑫，赵朝阳，徐增洪，
申请(专利权)人：中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，
类型：发明
国别省市：32
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