本发明专利技术公开了一种编码从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——甲壳肽的基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本发明专利技术还公开了从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽——甲壳肽的氨基酸序列。本发明专利技术还提供了该基因序列的用途，甲壳肽的用途。可以利用本发明专利技术的克氏原螯虾甲壳肽基因制备酵母表达载体，转染毕赤酵母获得工程菌株，诱导表达获得具有抗菌活性的重组蛋白。利用本发明专利技术获得的重组的甲壳肽可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种甲壳肽基因及其编码的蛋白与应用，尤其涉及一种克氏原螯虾甲 壳肽(Crustin)基因及其编码的甲壳肽与所述基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的 应用，属基因工程
技术介绍
众所周知，无脊椎动物虽然不存在适应性免疫，但它们具有强大的先天免疫防御 反应，包括细胞和体液免疫，依靠这些防御反应清除或消灭病原。体液免疫的主要效应分子 包括抗菌肽、酚氧化酶依赖性黑化系统和凋亡相关基因系统等；其中抗菌肽是多种生物体 内产生的可以抑制或杀死病原微生物的肽类或蛋白，是无脊椎动物重要的体液免疫效应分 子，是生物机体在抵御病原微生物的防御反应过程中所产生的一类物质，是宿主防御病原 微生物入侵的重要分子屏障。与传统抗菌药物相比，抗菌肽具有以下优点①稳定性高，在100°C加热IOmin条 件下仍能保持一定活力，且对较大的离子强度和较低或较高的PH值都有较强的抗性；②它 对正常真核细胞几乎没有毒性，仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞；③抗菌谱广，除 了抗细菌外，有的抗菌肽还能作用于真菌、原虫、病毒及癌细胞等；④由于抗菌肽的作用靶 标主要是细菌的细胞膜，因此病原菌不易对其产生耐药性；⑤不像其他抗生素那样由于死 亡的细菌释放内毒素而间接引起败血症，抗菌肽能够与内毒素结合从而减少或避免脓毒性 冲击。因而极有希望将抗菌肽开发成为一类新型的广谱高效抗菌药物。另外，抗菌肽还可 以应用到食品工业，能快速抑制微生物的生长，人、畜食后易被体内蛋白酶水解消化且无毒 副作用，在酸性条件下活性很强，具有良好的溶解性和稳定性，是一种极具发展前景的新型 食品防腐剂。抗菌肽在农业工程上也有应用，利用昆虫抗菌肽培育具有抗病菌品种的作物， 可大大减少农药用量，降低环境污染指数，生产出绿色农产品。昆虫抗菌肽被认为是最有发 展前景的绿色饲料添加剂，抗菌肽可促进动物生长，提高动物抗病能力，且不容易产生耐药 性。应用抗菌肽转基因工程技术，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产 生抗病新品种。可以预见，抗菌肽及其基因工程产品在医药卫生、食品工业、畜牧业及农业 等方面将发挥极为重要的作用，抗菌肽的市场应用前景必将更为广阔。甲壳肽(Crustins)是广泛存在于节肢动物的一类抗菌肽，最初在草食蟹中分离 得到的。甲壳肽的C端有一个比较保守的乳清酸蛋白结构域。根据氨基酸序列的不同，甲 壳肽可以分类为三类即I型、II型和III型甲壳肽。I型甲壳肽在信号肽区和乳清酸蛋白 结构域之间有一个半胱氨酸富含区。II型甲壳肽除了半胱氨酸富含区和乳清酸蛋白结构域 之外，还有一个甘氨酸富含区，III型甲壳肽含有一个乳清酸蛋白结构域和富含脯氨酸和精 氨酸的模体。I型甲壳肽主要存在于在鲎和淡水小龙虾中；II型和III型甲壳肽在对虾中 发现的比较多。甲壳肽一般具有对革兰氏阳性菌的抑菌活性。克氏原螯虾(Procambarus clarkii)，俗称淡水小龙虾，是我国重要的水产养殖品 种。小龙虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是一种营养价值很高的经济型水产养殖品种。而且小龙虾的虾壳的提取物在工业、农业、医药和化工业中有 着广泛的应用价值，因此，小龙虾的疾病预防和治疗方面的研究格外重要。小龙虾对环境的 适应能力较强，对各种流行性的疾病有一定的抵抗能力，鉴于此，研究小龙虾的抗菌肽对于 我们了解虾类的抗病机制有着重要的作用。 诸多研究表明，在虾类等节肢动物中存在多种可以抵抗外界病原微生物的蛋白或 肽类，如对虾素、甲壳肽(crustins)等，但是在相关的报导中，未见有克氏原螯虾的甲壳肽 基因的报导。
技术实现思路
针对上述现有技术，本专利技术的目的是提供--种编码从克氏原螯虾中克隆的抗菌肽一一甲壳肽的基因序列，并提供其重组表达与纯化方法。本专利技术的另一个目的是提供从-甲壳肽的氨基酸序列。本专利技术还提供了该基因序列的用克氏原螯虾中克隆的抗菌肽_ 途，甲壳肽的用途。本专利技术的克氏原螯虾甲壳肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示，其中所示fi 息为(a)序列特征*长度576碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源克氏原螯虾(Procambius clarkii)(f)序列描述:SEQ ID NO. 1atgctgcgcgtgctggtgttgtccatgctggtggtggcggccctcggccaccttccccga60cccaagcccccacagccgggctgtaactactactgcaccaagcccgagggcccaaacaag120ggcgccaagtactgctgcggtccccagttccttcccctaattagggaagaaaagcacaat180ggtttctgtcctcctcctctcaaggactgcacaagaatcctaccacctcaggtgtgcccc240catgacggacattgtcccataaaccagaagtgttgctttgacacctgtctcgacctccat300acctgcaagcctgcacacttttacatcaattagcttgagaggaatagcgtagtcgccgct360cctctgtgtggcacttcaagatggatctaagtcaatgatgattccctgagctgaactaca420acaatgctgtgcttataggttgttggctcgcttgttcactttgtattgtttggtgtttat480tttaaaggaatatatgtttcatgtataaatgagaggagttttgtctatta3.3. 3.3.3.3.3. 3.540ctttccaaaa576。本专利技术的克氏原螯虾甲壳肽基因编码的甲壳肽多肽，其氨基酸序列如SEQ ID 所示，其中所示信息为 (a)序列特征 *长度110氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(c)序列描述:SEQ ID NO. 2Met Leu Arg Val Leu Val Leu Ser Met Leu Val Val Ala Ala Leu510 15Gly His Leu Pro Arg Pro LysPro Pro GlnPro Gly Cys Asn Tyr2025 30Tyr Cys Thr Lys Pro Glu GlyPro Asn LysGly Ala Lys Tyr Cys3540 45Cys Gly Pro Gln Phe Leu ProLeu lie ArgGlu Glu Lys His Asn5055 60Gly Phe Cys Pro Pro Pro LeuLys Asp CysThr Arg lie Leu Pro6570 75Pro Gln Val Cys Pro His AspGly His CysPro lie Asn Gln Lys8085 90Cys Cys Phe Asp Thr Cys LeuAsp Leu HisThr Cys Lys Pro Ala95100 105His Phe Tyr lie Asn110。本专利技术还提供了所述的SEQ IDNO. 2所示氨基酸序列的变异体，它本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种克氏原螯虾甲壳肽基因，其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１所示，其中所示信息为： （ａ）序列特征： ＊长度：５７６碱基对 ＊类型：核酸 ＊链型：双链 ＊拓扑结构：线性 （ｂ）分子类型：ｃＤＮＡ （ｃ）假设：否 （ｄ）反义：否 （ｅ）最初来源：克氏原螯虾（Ｐｒｏｃａｍｂｉｕｓ ｃｌａｒｋｉｉ） （ｆ）序列描述：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ．１ ａｔｇｃｔｇｃｇｃｇ ｔｇｃｔｇｇｔｇｔｔ ｇｔｃｃａｔｇｃｔｇ ｇｔｇｇｔｇｇｃｇｇ ｃｃｃｔｃｇｇｃｃａ ｃｃｔｔｃｃｃｃｇａ ６０ ｃｃｃａａｇｃｃｃｃ ｃａｃａｇｃｃｇｇｇ ｃｔｇｔａａｃｔａｃ ｔａｃｔｇｃａｃｃａ ａｇｃｃｃｇａｇｇｇ ｃｃｃａａａｃａａｇ １２０ ｇｇｃｇｃｃａａｇｔ ａｃｔｇｃｔｇｃｇｇ ｔｃｃｃｃａｇｔｔｃ ｃｔｔｃｃｃｃｔａａ ｔｔａｇｇｇａａｇａ ａａａｇｃａｃａａｔ １８０ ｇｇｔｔｔｃｔｇｔｃ ｃｔｃｃｔｃｃｔｃｔ ｃａａｇｇａｃｔｇｃ ａｃａａｇａａｔｃｃ ｔａｃｃａｃｃｔｃａ ｇｇｔｇｔｇｃｃｃｃ ２４０ ｃａｔｇａｃｇｇａｃ ａｔｔｇｔｃｃｃａｔ ａａａｃｃａｇａａｇ ｔｇｔｔｇｃｔｔｔｇ ａｃａｃｃｔｇｔｃｔ ｃｇａｃｃｔｃｃａｔ ３００ ａｃｃｔｇｃａａｇｃ ｃｔｇｃａｃａｃｔｔ ｔｔａｃａｔｃａａｔ ｔａｇｃｔｔｇａｇａ ｇｇａａｔａｇｃｇｔ ａｇｔｃｇｃｃｇｃｔ３６０ ｃｃｔｃｔｇｔｇｔｇ ｇｃａｃｔｔｃａａｇ ａｔｇｇａｔｃｔａａ ｇｔｃａａｔｇａｔｇ ａｔｔｃｃｃｔｇａｇ ｃｔｇａａｃｔａｃａ ４２０ ａｃａａｔｇｃｔｇｔ ｇｃｔｔａｔａｇｇｔ ｔｇｔｔｇｇｃｔｃｇ ｃｔｔｇｔｔｃａｃｔｔｔｇｔａｔｔｇｔｔ ｔｇｇｔｇｔｔｔａｔ ４８０ ｔｔｔａａａｇｇａａ ｔａｔａｔｇｔｔｔｃ ａｔｇｔａｔａａａｔ ｇａｇａｇｇａｇｔｔ ｔｔｇｔｃｔａｔｔａ ａａｔａａａａａｔａ ５４０ ｃｔｔｔｃｃａａａａ ａａａａａａａａａａａａａａａａａａａａ ａａａａａａ ５７６。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王金星，赵小凡，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]
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