使用质量标签和次级离子质谱术的组织复用成像制造技术

本发明专利技术提供了一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像的方法。在某些实施方案中，该方法包括：用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品；用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描该样品以生成数据集，该数据集包括整个该样品区域中的质量标签的丰度的空间可寻址测量值；以及输出该数据集。在许多实施方案中，该数据集含有质量标签的标识和丰度。还提供一种用于进行该方法的系统。

Tissue multiplex imaging using mass labeling and secondary ion mass spectrometry

The present invention provides a method for generating a high-resolution two-dimensional image of a sample comprising a cell and an extracellular structure. In some embodiments, the method includes at least one quality label samples to generate labeled samples; using secondary ion mass spectrometry (SIMS) ion beam scanning the sample to generate data sets, addressable measurement value of the data set including the quality of the sample of the label abundance in the area of the space; and the output data set. In many embodiments, the data set contains the identification and abundance of a quality label. A system for carrying out the method is also provided.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】交叉引用本申请要求在2013年9月13日提交的美国临时专利申请序列号为61/877,733和2014年3月26日提交的美国临时专利申请序列号为61/970,803的优先权，其申请通过整体引用并入本文。政府权利本专利技术是根据由国家卫生研究院授予的合同号CA034233、AI057229、CA130826、EY018228、HHSN272200700038C、1K99GM104148-01在政府的支持下做出的。在本专利技术中政府具有某些的权利。专利技术背景在1942年首先在组织切片分析中采用抗体，以使在注入活菌的小鼠的器官活检中肺炎球菌抗原可视化。从那时起，免疫组织化学(IHC)已成为临床诊断和基础研究的支柱，其主要用于评价组织切片中一个或两个(罕见更多个)抗原的空间分布。尽管许多抗体的特异性高，但是大多数抗原的浓度不足以允许无信号放大的常规测定的检测。信号放大通常使用多价、结合一级抗体的Fc部分的酶联二级抗体来实现。在亮视场显微镜下，最常使用的报告酶是辣根过氧化物酶，通常用于氧化3,3'-二氨基联苯胺(DAB)，导致棕色沉淀积累。然而，使用二级抗体连同由于非线性染色使其与一级抗原浓度的相关性差限制可靠复用和定量。同时检测多种抗原可易受额外的制约，该制约限制现有的基于IHC的分析用于人体临床试验和临床诊断中预测生物标记物发展的效用。已经报道使用多个酶联二级抗体进行4个抗原的比色法检测，<br>但由于在样品制备和成像中所遇到的困难，在实践中该途径通常限制为两个。荧光标记可提供更高的信号噪声比，并更频繁地用于同时检测多个分子靶。实践中的限制包括需要在不同的宿主物种中生成的一级抗体和需要非重叠报告发射光谱。因此，该常规的IHC方法论不支持理解分子水平上组织微体系结构和表达之间的关系所需的复用、定量数据的稳健生成。专利技术概述提供了一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像的方法。在某些实施方案中，该方法包括：用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品；用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描该样品以生成数据集，该数据集包括整个该样品区域中的质量标签的丰度的空间可寻址测量值；以及输出该数据集。在许多实施方案中，该数据集含有质量标签的标识和丰度。可能以多种不同的方式用至少一种质量标签来标记该样品。例如，质量标签由组织化学染料组成，或它可能偶联于捕获剂，例如抗体。在其它情况下，该样品可能在活着时被注入质量标签，且该质量标签可能通过代谢已经并入该样品的其它分子。在某些实施方案中，标记步骤可能涉及将该样品与至少两种不同的特异性结合试剂接触，每一试剂包括不同的质量标签。在这些实施方案中，可扫描该样品以生成包括通过该样品的区域的每一质量标签的丰度的空间可寻址测量值的数据集。在具体实施方案中，可使用特异性结合试剂完成标记，如含有用作质量标签的螯合原子的抗体，其制作方法已知。在一些实施方案中，质量标签的质量在12-238个原子质量单位的范围内，例如，21至238个原子质量单位，包括C、O、N和F加合物。在一些实施方案中，质量标签可能是具有原子数在21-90范围内的元素的原子，例如，原子数21-29、39-47、57-79或89的元素。在一些情况下，元素是镧系元素。在一些情况下，该方法可能包括从数据集构建该样品的图像。在一些实施方案中，该图像的分辨率可高达1nm、5nm，例如，高达10nm、高达50nm、高达100nm、高达500nm或高达5000nm。在一些实施方案中，该方法还包括通过分割图像限定在图像中单独细胞的边界(以及，任选地，单细胞中亚细胞特征或其它所关注的特征)，其方法已知。在这些实施方案中，该方法可还包括整合对应于图像中每一单独细胞或其亚细胞特征的数据，其可提供整体描述细胞的一组值(每个对应于单个质量标签)。该方法的实施方案可还包括基于所获取的每一细胞的整合数据将单独细胞分类(例如分为细胞类型或分为正常或不正常等)。在这些实施方案中，该方法可还包括显示组织样品的图像，其中该细胞是按其分类以颜色编码(即，第一类细胞以第一种颜色表示，第二类细胞以第二种颜色表示和第三类细胞以第三种颜色表示等)。在一些情况下，在该图像的任一像素中，该像素的颜色强度与所获得的通过扫描获得的所述像素的信号整合幅度相关联。在一些实施方案中，将组织样品安装在导电基底上，且通过离子束对整个样品的光栅扫描(rastering)来完成扫描。可对合适的样品进行该方法，这些样品包括来自植物、动物和切片的包括微生物(例如，细菌、细胞)的样品。在具体实施方案中，该样品可以是组织切片，例如福尔马林固定、石蜡包埋(FFPE)切片，其厚度在例如2至20微米的范围内(例如3至12微米)。还提供了分析样品的系统。该系统可包括：a)包括保持包含样品的基底的支架的次级离子质谱术(SIMS)系统，其中所述系统配置为(i)用SIMS离子束扫描所述样品，并生成包括与所述样品结合的特异性结合试剂的丰度的空间可寻址测量值的数据集以及(ii)输出所述数据集；以及b)包括处理所述数据集以产生所述样品的图像的图像分析模块的计算机。所述支架处在可移动的阶段，可被控制至少在x和y方向(其在该样品的平面内)移动(例如，步进式或连续移动)以便于扫描。可将图像分析模块编程为执行上述方法的许多步骤。例如，在一些实施方案中，图像分析模块可分割所述图像来确定图像中单独细胞的边界，和，任选地，单独细胞内亚细胞特征。在一些情况下，图像分析模块可整合所述图像中每一单独细胞或其亚细胞特征的数据，以及任选地基于所获取的每一细胞的整合数据将单独细胞分类。图像分析模块还可显示组织样品的图像，其中所述细胞按其分类以颜色编码。如上所述，在所述图像的任一像素中，像素的颜色强度与所得的通过SIMS系统获得的所述像素的信号幅度相关联。附图简述当结合附图阅读时，可最好地理解以下详细描述的某些方面。要强调的是，根据惯例，附图的各种特征并不是按比例的。相反，为了表达清楚，各种特征的尺寸都任意地扩大或缩小。附图包括以下各图：图1：复用离子束成像(MIBI)的工作流程汇总。生物样本，如FFPE组织或细胞悬液，被固定在导电基底上，如铟锡氧化物涂层的玻璃或硅晶片。随后用与特有的过渡元素报告同位素偶联的抗体对样品进行染色，干燥以及在真空下装载以进行MIBI分析。用初级离子束(O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像的方法，所述方法包括：用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品，其中所关注的生物特征与所述至少一个质量标签结合；用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描所述样品以生成数据集，所述数据集包括整个所述样品区域中的所述至少一个质量标签的丰度的空间可寻址测量值；以及输出所述数据集。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.09.13 US 61/877,733;2014.03.26 US 61/970,8031.一种生成包括细胞和细胞外结构的样品的高分辨率二维图像
的方法，所述方法包括：
用至少一个质量标签标记样品，从而产生标记样品，其中所关注
的生物特征与所述至少一个质量标签结合；
用次级离子质谱仪(SIMS)离子束扫描所述样品以生成数据集，所
述数据集包括整个所述样品区域中的所述至少一个质量标签的丰度
的空间可寻址测量值；以及
输出所述数据集。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述至少一个质量标签是多
个可区分的质量标签，并且其中所述数据集包括所述多个质量标签中
每一个的丰度的标识和空间可寻址测量值。
3.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述数据集含有所
述质量标签的标识和丰度。
4.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述标记步骤包括
用至少两个不同的质量标签标记所述样品。
5.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述标记通过使用
连接到所述质量标签的抗体来完成。
6.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述标记通过将所
述质量标签施用到动物受试者并从所述受试者中获取所述样品来完
成。
7.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述样品是福尔马

\t林固定的石蜡包埋(FFPE)切片。
8.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述质量标签是具
有原子数在21-92范围内的元素的同位素。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述元素是镧系元素。
10.如任一项前述权利要求所述的方法，其中所述方法包括从所
述数据集构建所述样品的图像。
11.如权利要求10所述的方法，其中所述图像具有至少500nm
的分辨率。
12.如权利要求10所述的方法，其限定所述图像中单独细胞的
边界，以及任...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·C·本多尔，G·P·诺兰，R·M·安杰洛，
申请(专利权)人：斯坦福大学托管董事会，
类型：发明
国别省市：美国;US