新型温敏荧光化合物及其应用。本发明专利技术提供了式I所示化合物，其中R9是1‑22个碳原子的烃基或2‑3个碳原子的酯基取代的1‑3个碳原子的烷基，R5、R6、R7、R8均为烃基或H，和R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；或者，R9是2‑22个碳原子的烃基或2‑3个碳原子的酯基取代的1‑3个碳原子的烷基，和R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。本发明专利技术化合物具有温敏特性且能进入胞内，从而获得高时空分辨率的细胞内温度分布图像；本发明专利技术化合物还能对温敏荧光化合物作分布校准。本发明专利技术还提供了测量活细胞内温度分布的方法以及相应的检测试剂盒。该方法满足小尺寸测量和迅速测量的要求，从而实现空间和时间上的高分辨率。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及细胞检测领域。具体地说，本专利技术涉及新型的荧光染料以及利用此类 新型荧光染料检测活细胞内的温度分布。
技术介绍
在诸如新陈代谢、酶反应、细胞分裂、基因表达等细胞活动时，细胞的温度会发生 一定变化。这些细胞活动一般都伴随着ATP中化学能的释放，并产生热量使得温度上升。此 外，细胞在外界药物或信号刺激的情况下，其新陈代谢活性会发生迅速变化，从而导致胞内 温度的剧烈波动。然而由于胞外环境的热交换影响，这些胞内温度变化通常都较为局部，并 且呈瞬态特性，因此用传统的温度测量方法较难以测量这种胞内的温度变化。 据报道，红外热成像的方法被用来研宄UCP2在活细胞中的产热作用。红外热成像 的原理是基于所有物体都会发射一定量与温度相关的黑体辐射，也就是说，用红外热成像 的方法，无法区分细胞的温度与其生存环境（培养基）的温度。此外，红外相机工作波长一 般是14 μ m，根据光学分辨率的瑞利准则，工作在该波长的红外相机无法分辨出单个细胞。 因此红外热成像的方法不适用于胞内温度的探测。热电偶常常作为温度测量设备的探头来 测量目标的温度变化，扫描热成像显微镜是将隧道扫描显微镜或原子力显微镜的探针用热 电偶替换而发展来的。由于热电偶探头较为坚硬，该方法通常仅在电子工业中使用，以便得 到两维的微米或者纳米尺寸的热像图。最近报道中有学者设计了一种新型的热电偶材料用 来测量单个细胞的实时温度，该方法可以获得较高时间分辨率的温度曲线，但这只是单点 的测量，要得到两维的热像图其时间分辨率就大打折扣，并且这种接触式的测量，很可能破 坏细胞膜。因此基于热电偶的温度测量方案无法方便的对细胞进行热成像。 近年来，有学者报道了温敏荧光纳米材料可用于细胞温度变化的探测，在药物 刺激前后，整个细胞平均温度的变化可以用平均荧光强度的变化来显示。然而这种温敏荧 光纳米材料需通过注射的方法导入细胞，造成了对细胞的干扰和破坏；并且从报道的荧光 图像上可以看出，该纳米材料在细胞上的分布非常不均匀，只能看到一些小亮点，而温 敏荧光材料的荧光强度除了与温度有关，与其浓度分布也有关系，简单的将整个细胞上的 荧光强度进行平均来反映该细胞的温度可能存在一定问题。 综上所述，本领域急需开发新的荧光染料，从而能满足测量胞内温度所需的小尺 寸测量和迅速测量的要求，达到空间和时间上的高分辨率，进而获得高时空分辨率的细胞 内温度分布图像。
技术实现思路
本专利技术的主旨在于提供一种能够定位于细胞膜或穿透细胞膜进入细胞的温敏荧 光染料，从而能够准确、方便、迅速地测量胞内温度。 本专利技术的主旨还在于提供一种利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时的 温敏荧光化合物分布校准的方法以及用于所述校准方法的化合物。 其中， 在第一方面，本专利技术提供式I所示化合物，【主权项】1. 一种式I所示化合物， 其中，馬是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基， R5、R6、R7、馬均为径基或H，和 Rn R2、R3、R4均为H或低级烃基； 或者 馬是2-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和 R5与R1, R6与R 2, &与R 3,馬与R 4相连成六元环。2. 如权利要求1所示的化合物，其特征在于，所述化合物为下式所示化合物：其中， R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3个碳原子的烷基 R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和 Rn R2、R3、R4均为H或低级烃基； 或者 R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3个碳原子的烷基，和 R5与R1, R6与R2, &与R 3,馬与R4相连成六元环。4.如权利要求3所述的用途，其特征在于，所述化合物是下式所示化合物：5. 如权利要求3或4所述的用途，其特征在于，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构的 温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。6. 式I所示化合物或式2所示化合物在利用温敏荧光化合物测量活细胞内温度分布时 的温敏荧光化合物分布校准中的用途， 其中，馬是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基， 1?5、1?6、1?7、1?8均为!1，和 Rn R2、R3、R4均为H或低级烃基； 或者 馬是1-22个碳原子的烃基或2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，和 R5与R1, R6与R2, &与R 3,馬与R4相连成六元环。7. 如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述化合物是以下化合物：8. -种测量活细胞内温度分布的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤： 当利用温敏荧光化合物的反斯托克斯发光成像测量活细胞内温度分布时， (1)利用式I所示化合物对活细胞进行染色；其中， R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3个碳原子的烷基， R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和 Rn R2、R3、R4均为H或低级烃基； 或者 R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3个碳原子的烷基，和 R5与R i，R6与R 2, &与R 3,馬与R 4相连成六元环； (2) 在荧光显微镜下对步骤（1)所述染色的细胞进行成像； (3) 使用公式（1)对荧光图像进行计算： 相对焚光强度其中kB是玻尔兹曼常数，T是绝对温度，△ E是活化能，A是拟合常数，相对荧光强度是 式I所示化合物的反斯托克斯发光用该化合物自身的斯托克斯发光归一化之后的比值， 预先测定相对荧光强度随温度变化的标准曲线，利用公式（1)进行计算，从而得到活 细胞内温度的分布图像； 或者 当利用温敏荧光化合物的斯托克斯发光或反斯托克斯发光成像测量活细胞内温度分 布时， (1) 利用式I所示化合物以及校准荧光化合物对活细胞进行同时染色； 其中，R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3个碳原子的烷基， R5、R6、R7、R8独立选自烃基，和 Rn R2、R3、R4均为H或低级烃基； 或者 R9选自：1-22个碳原子的烃基，2-3个碳原子的酯基取代的1-3个碳原子的烷基，或芳 基取代的1-3个碳原子的烷基，和 R5与R i，R6与R 2, &与R 3,馬与R 4相连成六元环； (2) 在荧光显微镜下对步骤（1)所述染色的细胞进行成像； (3)根据温度变化与相对荧光强度的线性关系，利用预先测得的标准曲线进行计算，得 到活细胞内温度的分布图像，这里的相对荧光强度是指温敏荧光化合物的斯托克斯或反斯 托克斯发光强度用校准荧光化合物的斯托克斯发光强度作归一化处理所得到的比值。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述式I所示化合物是下式所示化合物：10. 如权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述活细胞内温度分布是亚细胞结构 的温度分布；优选地，所述亚细胞结构是细胞膜、胞浆或线粒体。本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种式I所示化合物，其中，R9是1‑22个碳原子的烃基或2‑3个碳原子的酯基取代的1‑3个碳原子的烷基，R5、R6、R7、R8均为烃基或H，和R1、R2、R3、R4均为H或低级烃基；或者R9是2‑22个碳原子的烃基或2‑3个碳原子的酯基取代的1‑3个碳原子的烷基，和R5与R1，R6与R2，R7与R3，R8与R4相连成六元环。
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：康建胜，谢涛嵘，刘春凤，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。