本发明专利技术公开了用于核酸扩增的改进方法，所述核酸扩增包括多重扩增，其中所述扩增是在两种或更多种不同的阶段中进行的。所述第一阶段扩增反应优选地缺乏指数级扩增所需的一种或多种组分。随后在扩增的第二、第三或进一步阶段(一个或多个)中提供所述缺乏组分，从而导致快速的指数级扩增反应。所述多阶段方案得到在低分析物浓度下更快速和更灵敏的检测，以及较低的可变性。还公开了用于进行所述受权利要求书保护的方法的组合物。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】多阶段核酸扩増 相关专利申请 本申请要求于2012年8月30日提交的美国临时申请No. 61/695, 106;和于2013 年7月15日提交的美国临时申请No. 61/846,538的权益。这些较早申请的全部公开内容 据此以引用方式并入。
本专利技术整体涉及分子生物学领域。更具体地讲，本专利技术涉及核酸的多阶段体外扩 增，所述扩增可用于增加单重反应和多重反应两者中扩增的效率和精度，以允许更灵敏地 检测核酸靶，该检测具有改进的定量特性并且在多重反应中分析物之间的干扰更少。
技术介绍
核酸扩增提供产生相对稀少或未知的核酸序列的多个拷贝的方式，以用于鉴定核 酸来源或者用于制备足够的核酸来提供易于检测的量。扩增可用于多种应用，例如测序、 诊断、药物开发、法医学鉴定、环境分析和食品检测。已知有多种用于体外扩增核酸序列的 方法，包括聚合酶链反应（PCR)、连接酶链式反应（LCR)、复制酶介导的扩增、链置换扩增 (SDA)、"滚环"型扩增，以及各种转录相关的扩增方法。这些已知方法使用不同技术来制备 扩增序列，所述扩增序列通常是使用各种方法来检测的。 PCR扩增使用DNA聚合酶、寡核苷酸引物以及热循环来合成双链DNA(dsDNA)或 者从cDNA制备的dsDNA的两条链的多个拷贝（美国专利No. 4, 683, 195、4, 683, 202和 4, 800, 159)。LCR扩增使用过量的单链探针的两个互补对，所述单链探针杂交至邻接靶序 列并且进行连接以形成与原始靶互补的融合探针，这允许所述融合探针在杂交、连接和变 性的多个循环中用作进一步融合的模板（美国专利No.5,516,663和EP 0320308 B1)。 复制酶介导的扩增使用连接到分析物序列的自复制RNA序列和复制酶（诸如Q0-复制 酶）来合成特异于所选复制酶的自复制序列（诸如，Q0病毒序列）的拷贝（美国专利 No. 4, 786, 600)。所述扩增序列作为分析物序列的替代物或报告分子而被检测出。SDA使 用含有限制性核酸内切酶的识别位点的引物，这使得所述核酸内切酶在包括靶序列的半 甲基化（hemi-modified)dsDNA的一条链上打开缺口，然后进行一系列引物延伸和链置换 步骤（美国专利No. 5, 422, 252和5, 547, 861)。滚环型扩增依赖于用作模板的环状或连 体（concatenated)核酸结构，以用于从所述模板酶法复制多个单链拷贝（例如，美国专 利No. 5, 714, 320和5, 834, 252)。转录-相关的扩增是指通过从核酸模板产生多个转录物 来扩增序列的方法。此类方法一般使用一种或多种寡核苷酸（其中一种寡核苷酸提供启 动子序列）和具有RNA聚合酶和DNA聚合酶活性的酶以在靶序列附近形成功能性启动子 序列，然后从启动子转录靶序列（例如，美国专利No. 4, 868, 105、5, 124, 246、5, 130, 238、 5, 399, 491、5, 437, 990、5, 554, 516 和 7, 374, 885 ;以及 PCT 公布 No. W01988/010315)。 核酸扩增方法可扩增特定的靶序列（例如，基因序列），一组相关靶序列，或可称 为标签序列的替代（surrogate)序列。此标签序列可用于多种目的，诸如检测、进一步扩 增、作为结合标签以用于固定化、作为衔接子以用于测序反应（包括下一代测序）中的多种 功能等。仅当所述分析物靶序列存在于反应中的某一点时该标签序列针对其预期目的发挥 作用。改进的核酸扩增方法可使用"通用"引物（一种或多种）或通用引物启动（priming) 来扩增不止一个潜在的靶序列。一种形式的PCR扩增使用结合至保守序列的通用引物来 在 PCR 反应中扩增相关的序列（Okamoto et al.，1992, J. Gen. Virol. 73:673-679 (Okamoto 等人，1992 年，《普通病毒学》，第 73 卷，第 673-679 H)，Persingetal.，1992，J.Clin. Microbiol. 30:2097-2103 (Persing 等人，1992 年，《临床微生物学》，第 30 卷，第 2097-2103 页）。使用通用引物的方法通常与种特异性、基因特异性或类型特异性的一种或多种引 物的使用配对，从而产生对于种、遗传性变型或者病毒类型唯一的扩增序列，所述扩增 序列可以通过测序或者检测扩增核酸的一些其他特性来鉴定。锚定PCR是另一种改进 的PCR方法，该方法使用通用引物或"衔接子"引物来扩增仅部分已知的序列。锚定PCR 将"衔接子"或"通用"序列引入cDNA中并且随后在后续的扩增步骤中使用结合至所引 入序列的引物。一般来讲，锚定PCR使用指向已知序列的引物来制备cDNA，将已知序列 (例如，聚鸟嘌呤）添加到cDNA中或者使用cDNA中的共有序列（例如，聚胸腺嘧啶）， 并且使用结合至该cDNA中的添加序列或共有序列的通用引物和下游靶特异性引物来进 行 PCR(Loh et al.，1989，Science 243:217-220(Loh 等人，1989 年，《科学》，第 243 卷， 第 217-220 页）；Lin et al.，1990, Mol. Cell. Biol. 10:1818-1821 (Lin 等人，1990 年，《分 子和细胞生物学》，第10卷，第1818-1821页）。巢式PCR可使用包含与分析物靶序列无 关的通用序列的引物（一种或多种）来在反应中由未知的靶序列扩增核酸（Sullivan et al.，1991，Electrophoresis 12:17-21 (Sullivan 等人，1991 年，《电泳》，第 12 卷，第 17-21 页）；Sugimoto et al.，1991，Agric. Biol. Chem. 55:2687-2692 (Sugimoto 等人，1991 年， 《农业与生物化学》，第55卷，第2687-2692页））。 Chamberlain et al. (Nucleic Acid Res.,1988,16:11141-11156)(Chamberlain 等人，《核酸研宄》，1988年，第16卷，第11141-11156页）首次展示了人类肌营养不良基 因的多重PCR分析。多重反应是通过对特异性引物的仔细筛选和优化完成的。开发稳健 的、灵敏的和特异性的多重反应需要大量特异性设计依据和经验性优化。这导致较长的开 发时间并且向降低测定灵敏度的反应条件妥协。继而，新型诊断测试的开发变得代价非常 高。已确定有多个限制多重反应的具体问题。掺入针对不止一个靶的引物组需要仔细匹 配反应效率。如果一个引物以甚至稍好一点的效率扩增其靶，那么扩增将变得偏向该更有 效扩增的靶，从而导致低效率的扩增、变化的灵敏度并且可能造成多重反应中其他靶基因 的完全失败。这被称为"优先扩增"。优先扩增有时可以通过将所有的引物序列按类似长 度和GC含量仔细匹配并且优化引物浓度（例如通过增加效率较低的靶的引物浓度）来校 正。也已经使用将肌苷掺入引物来试图调整引物扩增效率（美国专利No. 5, 738, 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种定量样品中的靶核酸序列的方法，包括以下步骤：(a)在允许第一扩增寡核苷酸杂交至所述靶核酸序列的第一部分的条件下，使所述样品与特异于所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一扩增寡核苷酸接触，从而产生包含所述第一扩增寡核苷酸和所述靶核酸序列的预扩增杂交体；(b)通过靶捕获到固体载体上，然后洗涤以移除任何未在步骤(a)中杂交至所述靶核酸序列的所述第一部分的所述第一扩增寡核苷酸来分离所述预扩增杂交体；(c)在支持在步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶核酸序列的至少一部分的线性扩增但是不支持其指数级扩增的条件下，在第一阶段扩增反应混合物中，在第一阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应中扩增所述在步骤(b)中分离的所述预扩增杂交体的所述靶核酸序列的至少一部分，从而获得包含第一扩增产物的反应混合物，其中，所述第一阶段扩增反应混合物包含第二扩增寡核苷酸，所述第二扩增寡核苷酸与所述第一扩增寡核苷酸的延伸产物的一部分互补，以及其中，所述第一扩增产物不是用于在所述第一阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应期间进行核酸合成的模板；(d)将包含所述第一扩增产物的所述反应混合物与参与所述第一扩增产物的指数级扩增但是在包含所述第一扩增产物的所述反应混合物中缺乏的至少一种组分合并，以产生第二阶段扩增反应混合物，其中所述第二阶段扩增反应混合物另外包含序列特异性杂交探针；(e)在第二阶段的、基本上等温的、转录相关的扩增反应中在所述第二阶段扩增反应混合物中进行所述第一扩增产物的指数级扩增，从而合成第二扩增产物；(f)用所述序列特异性杂交探针以固定的时间间隔检测所述第二阶段扩增反应混合物中所述第二扩增产物的合成；以及(g)使用从步骤(f)获得的结果来定量所述样品中的所述靶核酸序列。...
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：N·C·纳尔逊，小莱尔·J·阿诺德，L·戴，S·S·菲尔普斯，J·切利塞里，
申请(专利权)人：简·探针公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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