栀子的检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了栀子的特异性标记序列，还公开了检测前述序列的试剂在制备栀子检测试剂中的用途，以及栀子的检测试剂盒和检测方法。本发明专利技术检测试剂盒和检测方法可以准确、有效的鉴别栀子，特异性强，耗时短，应用前景良好。

【技术实现步骤摘要】
栀子的检测试剂盒和检测方法
本专利技术涉及一种栀子的检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
栀子，或药用栀子，(学名：GardeniajasminoidesEllis)，是茜草科植物栀子的果实。栀子的果实是传统中药，属我国卫生部(现计卫委)颁布的第l批药食两用资源，具有利胆、降压、镇静、护肝、止血、消肿等作用。在中医临床常用于治疗扭挫伤、黄疸型肝炎、高血压、糖尿病等症。水栀子是栀子药材常见的伪品，水桅子为茜草科植物大花桅子(GardneaijasminoidesEllisgrandifloraNakai)干燥成熟果实，近几年的全国各地大量种植，原来主要作为染料和色素，现发现常被当作栀子使用。其作伤科外敷药，不可内服。随着野生资源的减少，相应的伪品也在商品市场上更多地出现。栀子和伪品水栀子来源相近，两者特征接近，鉴别难度大。实际中常通过外观形状进行鉴别，但鉴别难度较大。
技术实现思路
为了克服现有技术的缺陷，本专利技术提供了一种新的、方便准确的栀子检测试剂盒和检测方法。本专利技术提供了SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。本专利技术提供了检测SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂在制备栀子检测试剂中的用途。其中，所述检测试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂。其中，所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2～3所示的引物对。本专利技术提供了检测栀子的试剂盒，包括检测SEQIDNO.1所述核苷酸序列的相关试剂。其中，所述试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂。其中，所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2～3所示的引物对。本专利技术提供了栀子的检测方法，包括如下步骤：a，提取样本DNA：提取待检样本中的DNA；b，检测：用前述的试剂盒检测待检样本，即可。本专利技术SEQIDNO.1所示核苷酸序列为栀子特异性标记序列，通过检测这些序列可以有效区分栀子和水栀子，鉴定待检样本是否为栀子，本专利技术方法操作简便，具有良好的应用前景。下面通过具体实施方式对本专利技术做进一步详细说明，但是并不是对本专利技术的限制，根据本专利技术的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本专利技术上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更，都是本专利技术保护的内容。附图说明图1.栀子DNA的改良RAPD扩增。通道1-6为水栀子分别来源于江西，福建，贵州，四川，湖南，浙江，通道7为采自泸州的栀子。箭头所指的为用于克隆的栀子的A1-1片段。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。图2.阳性克隆的菌落PCR鉴定。通道1-7为栀子A1片段的不同克隆。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。蓝色所指通道1的克隆A1-1用于酶切鉴定和Sanger测序。图3.阳性克隆的酶切鉴定。通道1为栀子A1-1克隆质粒DNA没有酶切，通道2为栀子A1-1克隆的质粒DNA用EcoRI酶切，通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。图4.栀子鉴定。蓝色所指的通道7的为栀子。通道1-6号样本分别是来自于江西、陕西、江苏、四川、湖南和浙江的水栀子花样本DNA。通道7的为栀子样本DNA。通道8-17按顺序为样本金银花、赶黄草，灵芝，荔枝，桂圆，龙荔，银杏，当归，青果，天麻的DNA。通道18为没有任何样本DNA阴性对照。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。图5.栀子和水栀子的区分。SCAR标记A1-1在不同栀子花DNA扩增。通道1-3号分别是来自于湖南和浙江的水栀子花，和泸州的栀子样本。通道“M”显示有分子重量(bp)的DL2000DNA标记。具体实施方式实施例1RAPD技术扩增栀子特异SCAR标记一、DNA提取收集6个地方的水栀子(江西，福建，贵州，四川，湖南，浙江)和野生的栀子(泸州)样本，将干组织约0.2g置于1.5mLEP管中,加入液氮约半分钟后用镊子碾碎成细粉,立即加入500μlCTAB提取缓冲液[CTAB2％，Tris-HCl(pH8.0)100mmol/L，EDTA20mmol/L，NaCL1.4mol/L，0.4％的β-巯基乙醇]，60℃水浴保温1小时后，加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1)抽提,轻颠倒混匀，10000r.min-1离心10min,吸取上清液，取上清加入2/3体积的预冷的异丙醇，轻轻上下颠倒混匀；12000r/min离心10min，弃上清，小心倾去上清液，沉淀用70％乙醇和无水乙醇各轻洗一次，弃洗液，留沉淀挥干。用100μl的TE溶解备用。1％琼脂糖凝胶电泳检测DNA的浓度和质量，将样品浓度稀释至10ng/μl，-20℃保存备用。二、RAPD技术PCR扩增RAPD技术进行扩增，通过RAPD引物A1扩增(5-CAGGCCCTTC-3)。PCR体系：1μl引物(2.5μmol/L),1.5μl(15ng)模板DNA，5μl的2×PCRTaqMastermix(天根生物公司，北京)和2.5μl双蒸水。PCR反应条件是：95℃1分30秒,94℃40秒，36度60秒，72℃1分30秒，40个循环，最后72℃5分，其中RAMP为5％。PCR仪器用AppliedBiosystems96-WellThermalCycler。然后用1.5％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，曝光。琼脂糖凝胶电泳：(1)脂糖凝胶的配置：用电子天平称取0.8g琼脂粉，加入1×TAE40ml，放入微波炉中充分溶解(中火至沸腾，中低火至沸腾2次)，置于实验桌上，加入EB2μl，混匀，待冷却至50℃备用；(2)用0.75mm16孔宽齿梳，配制胶板，将制胶板放入制胶槽中，将溶解的琼脂糖(约50℃)，倒入其中，直至厚度为6mm(如有气泡要把气泡赶出)，待其在室温下充分凝固后备用；(3)点样：(4)100V电泳45min。三、RAPD扩增条带的分离1.片段回收1.5％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，在紫外线下割下图1箭头所指的A1-1片栀子特有的片段，利用DNA琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒(天根生物公司)，回收片段。2.克隆接着利用PGEM-T载体(PromegaCorporation)，T4-DNA连接酶连接(16℃连接8小时)，连接后加入30μl的DH5α感受态细菌，冰浴30分钟，然后42℃45秒，冰浴2min，然后加入300μl无氨苄青霉素的LB培养基200r/min摇动45min，然后将液体加入含氨苄青霉素的固体LB培养基培养12小时。3.阳性克隆鉴定进行蓝白筛选，筛选白色菌落进行菌落PCR。挑选一个白色菌落，加入300μl含氨苄青霉素的LB培养基，220r.min2-3小时，取0.5μl培养基进行PCR反应。反应体系是：PCRmix5μl，DNA0.5μl,引物(SP6+T7)0.5μl，水4μl。PCR反应条件是PCR：95℃1分30秒，94℃40秒，58℃30秒，72℃40秒，30个循环，最后72℃5分。4.PCR阳性克隆做酶切鉴定，具体详见《精编医学分子生物学实验指导》(中国医药科技出版社，主编：傅俊江)。5.结果图2为阳性克隆的菌落PCR鉴定，其中通道1-7为栀子A1片段的不同克隆；取通道1的阳性克隆A1-1用于酶切鉴定和Sanger测序。图3为阳性克隆A1-1的酶切鉴定。通道1为栀子A1-1克隆质粒DNA没有酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。2.检测SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂在制备栀子检测试剂中的用途；所述检测试剂包括扩增SEQIDNO.1所示核苷酸序列的试剂；所述扩增的试剂包括SEQIDNO.2~3所示的引物对。3.一种检测栀子的试剂盒，其特征在于：包括检测SEQIDN...

【专利技术属性】
技术研发人员：梅志强，傅俊江，成竞梁，
申请(专利权)人：泸州医学院，
类型：发明
国别省市：四川;51