一种折叠引物及其PCR扩增方法技术

本发明专利技术涉及核酸扩增技术及其应用，尤其是一种折叠引物及其PCR扩增方法，通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，当低于其折叠温度时引物的3’5’端互补退火自我封闭；从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火，有效排除引物之间的竞争，有利于实行分级退火实现在一个试管内互不干扰地进行多重反应；使靶序列的特异扩增占据优势地位，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，有利于同时扩增和检出样本中多种靶核酸，特别是其中的低拷贝靶核酸。

【技术实现步骤摘要】
一种折叠引物及其PCR扩增方法
本专利技术涉及分子生物学
，尤其是一种折叠引物及其PCR扩增方法。
技术介绍
二十多年前聚合酶链式反应(PCR，Mullis.k1985)、耐热DNA聚合酶(Taq酶Saiki等1986)以及自动化热循环器(PCR仪——ThermoCycler.PECetus公司1987)先后问世，PCR核酸扩增技术以其在数小时内选择性扩增感兴趣的基因(核酸)片段达百万倍(拷贝)的巨大潜力，直接推动了分子克隆、生物与遗传工程、核酸序列分析(DNA,RNA测序)等分子生物学技术和分子生物学研究飞跃发展，促进了从微生物到人类的基因组计划的实施和完成。仅数年间，世界各种生物实验室中，PCR核酸扩增技术迅速占据了统治地位。目前核酸扩增技术已成为几乎所有涉及生物的研究与应用领域(包括生物与遗传工程，临床与预防医学，农、林、牧、渔以及食品、药品等生物相关产业)的分子生物学关键技术。使用核酸扩增技术从各种样本中获取、检出感兴趣的核酸序列，为各种核酸(基因)的进一步分析提供快捷可靠而又经济的手段；特别是证实含有1个或多个突变(变异、缺失、插入)，或者遗传多态(单核苷酸多态，SNP)的靶核酸的存在，进而达到确认或鉴定生物种、株(型)直到辨认个体的目的。现在，核酸扩增—鉴定的高效性、灵敏性和可行性已经没有人怀疑了，核酸扩增—鉴定—测序—进一步分析已成为生命科学研究的重要模式和必经之路，核酸扩增正在成为所有生物相关学科和产业应用最广泛、最重要的实用技术。聚合酶链式反应(PCR)是现有各种核酸扩增方法中效率最高、应用最广的基本核酸扩增方法。许多其他核酸扩增方法也是在其基础上发展起来。其基本原理是：是引物与目标(靶)核酸的互补退火与新生互补链的合成(延伸)：在适宜核酸合成的溶液(生化)环境中(含有必需的DNA聚合酶、至少一对寡核苷酸引物、靶DNA(模板)、Mg+、4dNIP以及适当且稳定pH的缓冲系统等)，在设定为核酸变性、退火和延伸3个温度循环变化的条件下，当温度上升到变性温度时模板靶DNA变性(解链)，降至退火温度时引物与互补的靶DNA结合退火，在延伸温度期间，通过DNA聚合酶催化作用，引物以靶DNA为模板，自其3端开始沿着5′—3′方向延伸，合成一条与靶DNA完全互补的新核苷酸链；第二个循环时，新合成的链作为反向引物的模板从另一个方向延伸，合成新链到前一个引物起始为止，从而限定了新链的设计长度，每个循环扩增产物以指数倍增，如此循环往复经过30个循环之后，完全同一的扩增产物可达到几十万到100万倍。可见引物的退火是核酸扩增反应中最关键的一步。PCR技术虽然具备上述极大的优势，但传统PCR也存在着固有的极易产生二聚体等非特异扩增、扩增产物极易污染以及多重反应时优势扩增掩盖低拷贝靶序列扩增三大缺陷，严重影响分析的准确性。在各种生物实验室里，它以最方便和高效的方式为我们获取无数有意义的核酸，同时也产生大量足以破坏试验结果的错误产物。故，该技术的应用需要专业的人员和严格的条件控制下才能产生较可靠的结果。而为了克服上述PCR核酸扩增技术固有的缺陷，也为适应核酸扩增技术在研究和应用各个领域的需要，20多年来分子生物学家们进行了不懈的努力，创造出多种改进的或派生的PCR技术，企图解决现有技术中存在的上述技术问题，例如技术文献为《Annealingcontrolprimeranditsuses》的公开了一种退火控制引物是在引物3′端和5′端之间插入2-15个通用碱基(脱氧肌苷等)组成一个调节器用于控制引物的退火，据称可适用于核酸扩增的所有领域，能有效地抑制非特异扩增和提高扩增和检出靶核酸的特异性；但未提及排除竞争和检出超微量靶核酸，特别是未提到在多重反应中检出低拷贝靶核酸的能力。又专利号为CN201110073636.5《用于快速恒温基因突变检测的聚合酶链反应方法》公开了一种聚合酶链式反应的方法也未提到解决竞争和多重扩增等问题。这些技术只是在不同程度上部分地减少了这些缺陷的影响，这些改进都没能从根本上改变和解决这些技术问题；使得在不断扩增靶核酸的同时产生大量的非靶扩增产物，形成非靶扩增与靶核酸扩增竞争有限资源的严重局面，轻则干扰结果判断，重则非靶核酸的优势扩增形成垄断甚至完全抑制靶核酸的扩增，导致假阴性，进而造成易污染的现状；如在临床和预防医学领域，以PCR核酸扩增技术为基础的各种分子(核酸、基因)诊断方法的研究和应用报告已遍布绝大部分传染病和遗传性疾病(病变、突变基因)，几乎覆盖所有致病病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原微生物。但在临床诊断、疾病控制和环境监测中采集的样本核酸是有限(微)量的，特别是有些病人(潜伏期、恢复期以及健康带菌者)的样本中带菌(毒、虫)量往往很低；而医学诊断不仅要求从一份样本中检出低含量病原(变)基因，还要求同时进行鉴别诊断，最好能一次试验检出多种(型、株)病原基因；这就需要更高的准确性和稳定性的多重反应，而且要求试验步骤高度简化使普通试验室人员可以操作，要求更高的试验速度快速出结果以适应及时治疗病人的需要。而现有技术中的PCR技术根本难以满足需求。
技术实现思路
为了解决现有核酸扩增技术中存在的上述技术问题，本专利技术提供一种具有三重退火温度和自我封闭功能的折叠引物，及其应用于聚合酶链式反应(折叠引物PCR,但不限于此)从含有靶基因的核酸的样本中选择性扩增并检出一种或多种靶核酸序列的方法；通过设定每条(对)折叠引物不同的退火和折叠温度，利用退火温度变化控制引物折叠自身封闭与开放进行分级退火，排除引物之间的竞争，在一个试管内多对引物互不干扰地进行多重反应；使靶序列的特异扩增占据优势地位，从根本上阻止引物与任何非靶序列之间的错配退火，有效地解决传统PCR普通引物极易产生非特异扩增、在多重反应中难于扩增低拷贝靶序列以及扩增产物极易污染等弊病；因此大大增强了检出SNP等单碱基变异的特异性和敏感性，有利于扩增和检出样本中微量病原DNA，特别有利于检出混合感染样本中低拷贝数的靶核酸。具体是通过以下技术方案得以实现的：一种折叠引物，该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度(或低温退火温度)；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度。所述折叠引物的3′端常规引物部分，其3′末端第2-4位特设1-2个脱氧肌苷和/或取代错配碱基。所述的折叠引物5′端特殊设计引物部分，特殊设计引物部分与3′端互补序列是从第2-4碱基起至第8-20碱基添加7-19个与3′端互补碱基，而5′末端第1位则特设为与3′末端本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种折叠引物，其特征在于：该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度(或低温退火温度)；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度。

【技术特征摘要】
1.一种折叠引物，其特征在于：该折叠引物在PCR反应中具有三重退火温度和自我封闭的功能；所述的折叠引物包括3′端常规引物部分和5′端特殊设计引物部分；其3′端常规引物部分为根据需要检出和/或鉴定的特异位点设计与靶基因互补的一段核苷酸序列，其组成和长度决定引物与靶序列退火温度的上限，称为引物的初始退火温度；其5′端特殊设计引物部分主要由常规引物部分的5′端添加与其3′端互补的碱基组成；该互补碱基的组成和长度决定引物折叠自身退火的温度，该引物自身退火达100％的温度称为折叠温度，决定初始退火温度的下限；所述的折叠引物PCR反应经过至少2个循环后，扩增子的5′端已生成折叠引物全长的互补序列；此后的引物延伸扩增主要以扩增子为模板，此时折叠引物全长与扩增子互补退火，而不只是常规引物部分，折叠引物的退火温度将自动升高≥5℃，称为二级退火温度；折叠引物的PCR扩增方法，包括以下步骤：(1)采用镁、酶分离组合试剂模式，分别配制至少含有1对折叠引物的无镁加酶组合试剂和制备含镁模板DNA；在一个PCR管内加入10ul无镁加酶组合试剂和5ul含镁模板形成完整反应体系，即可上机反应；(2)折叠引物PCR反应:预热后先进行至少1组初始退火温度循环，在循环内或/和循环组间至少用2个初始退火温度分级退火，每组至少扩增2个循环；随后进入高温退火循环组：在循环内用1-3个高温退火温度分级退火扩增36-56个或更多循环；在60-70分钟内连续扩增60个或更多循环，可完成从简单到复杂的多重反应；(3)扩增产物分析鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳分离鉴定；或采用高效质谱测定扩增片段的分子量对比数据库储存的同类或类似种群数据进行鉴定；也可采用微阵列或低密度芯片技术鉴定扩增片段；所述引物序列为：5’CCGTGATGTGGAGAATGTTTTGCATCACIT3’。2.如权利要求1所述折叠引物，其特征在...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄天谊，
申请(专利权)人：黄天谊，
类型：发明
国别省市：贵州;52