玉米转录因子ZmPIF3.2基因及其应用制造技术

本发明专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及一种与玉米耐旱耐盐相关的转录因子基因及其应用。该基因为玉米PIFs家族转录因子基因ZmPIF3.2,其序列如SEQ ID NO.5所示。水稻转化的功能分析表明提高了转基因水稻的耐旱及耐盐能力,可用于其他作物的抗逆转基因应用。该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。

【技术实现步骤摘要】
玉米转录因子ZmPIF3.2基因及其应用
本专利技术属于作物遗传育种领域，具体涉及玉米转录因子ZmPIF3.2基因的功能及其应用。
技术介绍
全球干旱、半干旱地区约占耕地面积的一半，这些地区水分供应不足，森林植被疏稀，生态环境恶化，水土流失严重，自然灾害频繁。即使在土壤水分充足的情况下，水分亏缺也常常会发生，从而影响到光合作用、物质运输、蛋白质合成和细胞伸长等生理过程。干旱、高盐会造成植物不同程度的脱水，引起植物体内一系列的生理代谢变化，所以又将干旱、高盐等非生物胁迫称为水分胁迫，或渗透胁迫。植物应答渗透胁迫的过程是一个涉及到多基因、多信号途径、多基因产物的复杂过程，大体上可将这些基因及其表达产物分成两类,即功能蛋白和调节蛋白。功能蛋白是指在抵抗渗透胁迫中直接起作用的蛋白质；而调节蛋白是在逆境中参与各种信号转导或调控基因表达，间接起保护作用的蛋白，主要包括：传递信号和调控基因表达的转录因子等。植物在逆境胁迫下可诱导合成大量抗逆的化合物和蛋白质，这些与抗逆境相关的化合物和蛋白质又受转录因子在转录水平上的调控.转录因子可以通过与顺式作用元件结合，启动抗逆相关功能基因的转录，通过抗逆功能基因的表达使植物作出适应逆境胁迫的代谢调整。近年来，在提高作物抗逆性的分子育种中，研究重点已逐渐从改良个别基因转到改良或增强一个或多个发挥关键作用的转录因子上，这样能促使多个功能基因发挥作用，以期获得综合抗逆性状改良的植物。植物PIFs家族转录因子能够与CANNTG序列(又称E-box)发生特异性作用，调节启动子中含E-box元件的功能基因或调控基因的表达，从而参与植物的各种抗逆性反应。目前有关PIFs家族转录因子的研究大部分来自拟南芥，而其它物种的研究报道不多。本专利技术以玉米为研究材料，以拟南芥中的转录因子PIF3为查询序列，同源搜索玉米核苷酸数据库，通过生物信息学的方法找到玉米中的PIF3转录因子基因。拟南芥转录因子PIF3是能与光敏色素直接相互作用的信号因子,通过与被光活化的光敏色素相互作用将光信号传导下去，即在光信号传导中发挥作用。有关PIF3的研究报道主要与光信号路径相关，未有其在非生物胁迫中的研究报道。ZmPIF3和ZmPIF3.2是以拟南芥中PIF3为查询序列，由玉米核苷酸数据库中得的两个与PIF3高度同源的序列，设计引物并克隆获得后，将其命名为ZmPIF3和ZmPIF3.2。它们的序列尚未公布报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供玉米转录因子ZmPIF3.2基因的序列及功能，并进一步公开了该基因的应用。本专利技术通过对ZmPIF3.2基因在玉米受干旱及高盐胁迫时的表达模式判断，该基因可能参与植物抗逆途径。根据该基因的序列设计引物，利用RT-PCR技术从玉米品种郑单958(购于扬州田源种业公司)总cDNA中扩增得到ZmPIF3.2基因。利用农杆菌介导法转化到野生型水稻植株中，并研究其在水稻体内的抗逆功能，为ZmPIF3.2基因在其他植物上的应用提供了很好的基础。玉米ZmPIF3.2基因，其序列如SEQIDNO.5所示。它所编码的蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示。本专利技术所述的玉米ZmPIF3.2基因可用于植物转化，提高植物的耐旱耐盐能力。本专利技术还公开了一种提高植物耐旱耐盐能力的方法，即利用玉米ZmPIF3.2基因转化目标植物，从而获得转基因植物。所述的提高植物耐旱能力的方法，包括下述步骤：(1)获得玉米转录因子基因ZmPIF3.2核酸序列及氨基酸序列，(2)用RT-PCR获得玉米ZmPIF3.2基因片段，(3)利用电击法将带有ZmPIF3.2的质粒转化农杆菌，(4)将带有转化质粒的农杆菌转化目标植物，得到转基因植物。本专利技术根据玉米基因组序列(KJ727969)设计如下引物：F：5’-ATGTCCGACAGCAACGACT-3’(SEQIDNO.1)，R:5’-CTATTTTTGTAGTATTTGTGGATCTC-3’(SEQIDNO.2)。利用RT-PCR技术从玉米郑单958总cDNA中扩增得到ZmPIF3.2基因全长cDNA(开放阅读框部分)。经测序表明为PIFs家族转录因子，ZmPIF3.2的全长cDNA为1704bp(SEQIDNO.5)，编码一个由567个氨基酸组成的蛋白(SEQIDNO：6)。本专利技术根据ZmPIF3.2基因的cDNA序列设计如下检测引物：F:5’-GCAGTCGCTACTCCATCGC-3’(SEQIDNO.3)，R:5’-TCCTCGCATCCCACCAGAC-3’(SEQIDNO.4)。检测玉米经过PEG、NaCl、ABA和冷处理后体内ZmPIF3.2基因的表达情况。结果表明ZmPIF3.2受PEG、NaCl、ABA和冷诱导表达。本专利技术将含ZmPIF3.2的质粒经BglII+EcoRI双酶切后，利用DNA回收试剂盒回收1704bp(SEQIDNO.5)左右的DNA片段，将此片段与相应酶切的p1011载体相连构建成一个新的载体，命名为p1011-ZmPIF3.2。本专利技术利用电击法将构建好的双元载体p1011-ZmPIF3.2导入根癌农杆菌中，根癌农杆菌菌株为EHA105。通过农杆菌介导法将ZmPIF3.2基因转化到水稻中，对目标植物转基因阳性苗进行鉴定，对目标植物转基因T2代阳性纯合植株的筛选；对转基因纯合植株进行抗逆分析；验证了转基因水稻对干旱、高盐胁迫的耐受能力得到提高。本专利技术的ZmPIF3.2基因是能够针对性调控植物耐旱和耐高盐能力提高的转录因子基因；且该抗逆基因来自植物本身，对环境影响较小。本专利技术通过对ZmPIF3.2基因转化水稻进行该基因的功能研究，获得效果如下：1.获得了对干旱及高盐胁迫有较高耐受性的转基因水稻。2.ZmPIF3.2基因具有抵抗干旱和高盐胁迫逆境的功能，为利用该基因在其他植物上的应用而提高植物抗逆性提供了理论依据及利用价值。附图说明图1ZmPIF3.2与拟南芥PIF3家族转录因子保守区的氨基酸序列同源性比对。图2ZmPIF3.2与拟南芥PIFs转录因子氨基酸序列比对后所作进化树。图3ZmPIF3.2基因在PEG、NaCl、ABA和低温条件下的诱导表达谱变化情况。图4ZmPIF3.2转基因水稻T2代纯合株系内荧光定量检测。WT：野生型；VC：空载体；OE1-OE11：ZmPIF3.2转基因水稻。图5ZmPIF3.2转基因水稻在溶液中的耐旱性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE1、OE3、OE7：ZmPIF3.2转基因水稻。图6ZmPIF3.2转基因水稻在土壤中的耐旱性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE1、OE3、OE7：ZmPIF3.2转基因水稻。图7ZmPIF3.2转基因水稻在溶液中的耐盐性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE1、OE3、OE7：ZmPIF3.2转基因水稻。图8ZmPIF3.2转基因水稻在土壤中的耐盐性研究。WT：野生型；VC：空载体；OE1、OE3、OE7：ZmPIF3.2转基因水稻。具体实施方式实施例1：玉米转录因子ZmPIF3.2核苷酸序列及氨基酸序列的获得登陆公共数据库NCBI主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，搜索到拟南芥中转录因子PIF3的氨基酸序列，以此氨基酸序列为查询探针，获得了本文档来自技高网...

【技术保护点】
玉米转录因子ZmPIF3.2基因，其序列如SEQ ID NO.5所示。

【技术特征摘要】
1.玉米转录因子ZmPIF3.2基因，其序列如SEQIDNO.5所示。2.玉米转录因子ZmPIF3.2蛋白，其序列如SEQIDNO.6所示。3.权利要求1所述玉米转录因子ZmPIF3.2基因在提高水稻耐旱耐盐能力中的应用。4.一种提高水稻耐旱耐盐能力的方法，是用权利要求1所述的玉米转录因子ZmPIF3.2基因转化水稻，获得转...

【专利技术属性】
技术研发人员：高勇，陈建民，江薇，戴毅，陆怡，吴美琴，任小芸，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32