一种玉米耐盐基因及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种玉米耐盐基因ZmHKT1；1b，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明专利技术还提供了有所述基因编码的玉米HKT转运蛋白及所述基因ZmHKT1；1b在转化植物中的应用。本发明专利技术所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1b及重组载体，本发明专利技术所提供的基因ZmHKT1；1b可以应用于提高转基因作物的耐盐能力。

【技术实现步骤摘要】
一种玉米耐盐基因及其应用
本专利技术涉及基因工程领域，特别涉及一种玉米耐盐基因ZmHKT1；1b及其应用。
技术介绍
盐胁迫是影响作物生长发育和产量的主要非生物胁迫因素之一。据统计，在全世界范围内，大约有4.5亿公顷的可耕作土地正在遭受着不同程度的盐渍化，而且由于全球气候的不断变化以及不合理的施肥灌溉等原因，土壤盐渍化的范围也将不断扩大，这将严重地制约我国的经济和社会的发展。因此，除了利用一些传统的手段和方法来改善土壤外，培育耐盐农作物新品种已成为当务之急。由于植物耐盐性状自身的复杂性，使得采用传统的育种方法很难获得具有耐盐特性的优良品种。随着生物技术的发展，通过导入外源基因来提高农作物的耐盐性已成为现代作物育种的主要潮流。利用基因工程技术将具有优良性状的基因转入植物，以此来开发高效的转基因作物新品种是一项具有广阔应用前景的技术。就目前的研究情况而言，利用转基因技术在提高作物耐盐性方面已经取得了较大的进展，已有的部分研究表明，将耐盐基因过表达或者转入其它生物中，其异源转录产物和翻译产物可以提高转基因植物的耐盐性。HKT转运蛋白是一类非常重要的蛋白质，根据其第一个孔环结构(poredomain，PD)氨基酸组成的不同主要将其分成两大类，不同类型的HKT转运蛋白在功能上具有显著的差异。近年来，有关小麦、水稻、拟南芥等植物的HKT转运蛋白在植物耐盐过程中发挥的作用已经被先后报道，但是关于玉米中的HKT转运蛋白在植物耐盐过程中的作用的研究尚未见报道。因此，有必要对与玉米HKT转运蛋白的编码蛋白进行分离，从而为后期利用玉米KHT转运蛋白对植物进行定向改造奠定基础。专利
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的玉米耐盐基因及重组载体和应用。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先提供一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1b，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。本专利技术的专利技术人在对玉米的耐盐机制进行研究的过程中，对玉米进行盐胁迫处理后提取玉米叶片总RNA后反转录得到了如SEQIDNO:1所示的DNA序列。具体的，所述基因ZmHKT1；1b是按照以下方式获得的：将生长10天的玉米B73幼苗从蛭石：营养土比例为1:1的花盆中取出，并洗掉玉米根部的蛭石。然后将幼苗根部浸入浓度为250mmol/LNaCl溶液中通气培养，取盐胁迫处理1h后的玉米叶片为材料，进行RNA的提取等后续试验。以盐胁迫处理后的玉米B73叶片为材料，提取叶片总RNA后反转录成cDNA，以cDNA为模板，分别在其5’UTR和3’UTR设计In-fusion引物进行PCR反应，上游引物为：ZmHKT1；1b-infusion-F(SEQIDNO：3)，下游引物为ZmHKT1；1b-infusion-R：(SEQIDNO：4)。50μL反应体系：5×TransStartFastPfuBuffer10μL，TransStartFastPfuDNAPolymerase1μL，2.5mMdNTPs5μL，ZmHKT1；1b-infusion-F1.5μL，ZmHKT1；1b-infusion-R1.5μL，cDNA2μL，ddH2O29μL。反应程序：95℃预变性5min，然后95℃解链30sec，56℃退火30sec，72℃延伸45sec，反应32个循环，72℃延伸7min。将PCR产物切胶回收后用凝胶回收试剂盒(AXYGEN)回收纯化获得SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。本专利技术还提供了一种玉米HKT转运蛋白，其特征在于：由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。应当理解的是，本领域技术人员可以根据SEQIDNO:2所示的氨基酸序列在不影响其活性的条件下，对该序列进行取代、缺失或插入一个或几个氨基酸以获得具有同等活性的蛋白质。本专利技术还提供了所述基因的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为pCAMBIA3301-ZmHKT1；1b。本专利技术还提供了含有所述基因的工程菌，包括宿主细胞和转入宿主细胞的目的基因，所述目的基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。可选的，所述基因工程菌内含有重组载体pCAMBIA3301-ZmHKT1；1b的核苷酸片段，本专利技术还提供了玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKT1；1b在转化植物中的应用。进一步地，所述植物包括玉米、烟草、水稻、棉花、大豆、高粱。优选的，当所述植物为烟草时，能够取得最好的提高耐盐能力的效果。进一步地，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKT1；1b，从而使得玉米表达具有SEQIDNO：2所示的氨基酸序列的蛋白，提高烟草的耐盐能力。本专利技术所获得的有益效果在于：提供了一种能够在植物中稳定高效表达玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1b及重组载体，本专利技术所提供的基因ZmHKT1；1b可以应用于提高转基因作物的耐盐能力。附图说明图1为植物重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT1；1b片段图谱其中ZmHKT1；1b代表玉米HKT转运蛋白的编码基因。图2为ZmHKT1；1b转基因烟草植株T2代的PCR鉴定M，D2000Maker；1，H2O；2，野生型烟草；3和4，分别为2-3、2-8转基因株系。扩增产物大小为942bp。图3为ZmHKT1；1b转基因烟草植株T2代的RT-PCR分析M，D2000Maker；1，H2O；2，野生型烟草；3和4，分别为2-3、2-8转基因株系。目的基因ZmHKT1；1b的扩增产物大小均为259bp，参照基因Actin的扩增产物大小为106bp。图4为T2代ZmHKT1；1b转基因烟草幼苗在不同浓度NaCl处理后的生长状况I表示在0mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况，II表示在200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况，III在300mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草的生长状况。其中2-3和2-8是转基因株系。图5为盐胁迫对T2代ZmHKT1；1b转基因烟草幼苗鲜重的影响横坐标代表不同的烟草株系，纵坐标代表烟草幼苗的鲜重(FW)。200表示在200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况，300表示在300mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况。WT代表野生型烟草幼苗，2-3和2-8是转基因幼苗。**表示有极显著差异(P<0.01)。图6为盐胁迫对T2代ZmHKT1；1b转基因烟草幼苗主根长的影响横坐标代表不同的烟草株系，纵坐标代表烟草幼苗的主根长(MRL)。200表示在200mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况，300表示在300mMNaCl处理下转基因株系与野生型烟草幼苗的鲜重变化情况。WT代表野生型烟草幼苗，2-3和2-8是转基因幼苗。**表示有极显著差异(P<0.01)。具体实施方式下面将通过具体实施方式对本专利技术进行详细说明。实施例1玉米HKT转运蛋白的编码基因ZmHKT1；1b的获得以及植物表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT1；1b的构建。将生长10天的玉米B73幼苗从蛭石：营养土为1:1的花盆中取出，并洗掉玉米根部的蛭石。然后将幼苗根部浸入浓度为250mmol/LNaCl溶液中通气培养，取处理1h后的玉米叶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1b，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

【技术特征摘要】
1.一种编码玉米HKT转运蛋白的基因ZmHKT1；1b，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。2.一种玉米HKT转运蛋白，其特征在于：由SEQIDNO:2所示的氨基酸序列组成。3.含有权利要求1所述基因ZmHKT1；1b的重组表达载体pCAMBIA3301-ZmHKT1；1b。4.含有权利要求1所述基因ZmHKT1；1b的工程菌。5.权利要求1所述的基因ZmHKT1；1b在转化植物中的应用，所述的植物为玉米、烟草。6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述应用是在烟草内转化所述基因ZmHKT1；1b，提高烟草的耐盐能力。7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，所述应用的步骤包括：从含有50μg/mL利福平的YEB平板上挑取农杆菌EHA105单克隆，接种于50ml含50μg/mL利福平的YEB液体培养基中，200rpm，28℃培养至OD值为0.5，然后菌液冰浴30min，将菌液转移至无菌的离心管中，4000rpm离心，收集菌液，将菌液悬浮于2mL预冷的含20％的甘油的100mMCaCl2溶液中，200μL/管分装，待用；取5μL的p...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘允军，任珍静，王国英，
申请(专利权)人：中国农业科学院作物科学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11