本发明专利技术属于生物工程制药技术领域和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具体涉及针对整合素受体具有高亲和力的且兼具抗肿瘤作用的多肽及其应用，其具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，药效学实验证明本发明专利技术的多肽可用于癌症诊断和治疗中。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程制药
和蛋白质多肽类药物及生物医学工程领域，具 体涉及针对整合素受体具有高亲和力的且兼具抗肿瘤作用的多肽及其应用，例如用于癌症 诊断和治疗中。
技术介绍
目前，癌症已经成为全球人类的头号杀手，癌症的治疗主要以手术、化疗和放疗 为主，但是化疗药物作用大多是非选择性的，体内分布广，治疗剂量下对正常组织器官毒 副作用大，虽然患者病情能得到暂时缓解，但疗效都不是很理想。因而迫切需要有一种创新 性、突破性的早期诊断和治疗手段。 整合素受体（Integrin)为细胞黏附分子家族的重要成员之一，主要介导细胞与 细胞、细胞与细胞外基质（ECM)之间的相互作用，并介导细胞与ECM之间的双向信号传导。 其在细胞迀移、分化及胚胎发育、血管生成、伤口愈合、免疫和非免疫防御机制、凝血和细胞 的致癌转化过程中起着非常重要的作用。整合素受体是由《和e亚基以非共价键结合 而形成的跨膜异二聚体糖蛋白，属于I型膜蛋白，迄今已发现由18种不同的a亚基和8 种0亚基组成的24种整合素。很多整合素受体都与机体病理或病理生理反应有很大关 系，因此它们是疾病治疗过程中非常重要的靶点，特别是与血管生成和实体瘤转移有关的 av0 3、av0 5、a501整合素受体，极有可能成为肿瘤治疗的革巴点。 目前3肽（序列为精氨酸-色氨酸-精氨酸）是证明对整合素aV0 3具有高亲 和力的多肽（见CN201310019870. 9)，13肽（序列为甘氨酸-壳氨酸-苯丙氨酸-天冬氨 酸-异亮氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苯丙 氨酸-NH2)是Aurein家族中活性最强的成员之一，肽链中央两亲性a-螺旋结构与其活性 密切相关，是迄今为止报道的既有广谱抗菌又有广谱抗癌活性的最小的两栖类抗菌肽（详 见参考文献：RozekT,WegenerKL,BowieJH,etal.Theantibioticandanticancer activeaureinpeptidesfromtheAustralianBelIFrogsLitoriaaureaand Litoriaraniformis.EurJBioche，2000,267 (17):5330 ?5341)。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供能够与整合素受体相关的抗肿瘤多肽，使其能够对整合 素受体高表达肿瘤进行体内体外诊断，并成为肿瘤治疗药物。 本专利技术所述的多肽是在3肽及13肽的基础上由20个氨基酸组成，其具有SEQID No:1所示的氨基酸序列。本专利技术前期研宄中同时还制备了 16肽和18肽，其序列分别如下： 16肽序列：精氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨酸-天冬氨酸-异 亮氨酸_异亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸_异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丝氨酸-苯丙氨酸-NH2 18肽序列：精氨酸-色氨酸-精氨酸-甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸-亮氨酸-苯丙氨 酸-天冬氨酸-异亮氨酸-异亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-异亮氨酸-丙氨酸-谷氨酸-丝 氨酸-苯丙氨酸-NH2 为了检测本专利技术多肽的药理活性，体外实验通过荧光染料罗丹明B对多肽进行标 记，以检测其对肿瘤的靶向性，体内实验通过荧光染料ICG-Der-02与多肽连接，通过体内 荧光强度来检测多肽的靶向性。 体外肿瘤细胞亲和力实验与体外肿瘤细胞靶向实验中本专利技术的20肽对整合素高 表达的人脑胶质瘤U87MG细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞有很强的靶向性，且靶向性强于 其他的肽。在体外MTT增殖抑制实验中3肽无任何抑制肿瘤细胞增殖的能力，而20肽具有 比13肽强的抑制肿瘤细胞增殖能力，且20肽对于正常细胞的损伤远小于13肽对正常细胞 的损伤。体内肿瘤抑制实验中20肽展示了远远强于13肽的治疗效果。13肽无靶向能力， 而20肽具有很强的靶向能力，3肽无抗肿瘤作用，而20肽有很强的抗肿瘤作用，同时在3肽 与13肽基础上改造的16肽及18肽细胞毒性及靶向性方面的结果都较20肽差。由此可见 20肽不仅能够对整合素受体高表达肿瘤进行体内体外诊断，而且具有成为肿瘤靶向治疗的 药物。 下面是本专利技术部分药效学实验： 一、体外肿瘤细胞亲和力实验 本专利技术应用于体外细胞实验的荧光染料为罗丹明B(RhodamineB)，分别与上述3 肽，13肽，16肽，18肽及本专利技术20肽通过酰胺键连接，简称分别为RhB-3,RhB-13,RhB-16， RhB-18与RhB-20,连接方法具体为取Img罗丹明B(详见参考文献：JieCao，Shunan Wan,JunmeiTian,SiwenLi,DaweiDeng.FastclearingRGD-basednear-infrared fluorescentprobesforinvivotumordiagnosis,ContrastMediaMol.Imaging 2012,7390 - 402)溶于ImlPBS(pH为7. 4)中，加入I-乙基-(3-二甲基氨基丙基）碳酰二 亚胺盐酸盐，N-羟基琥珀酰亚胺（EDC/NHS)(摩尔比RhodamineB:EDC=NHS= 1:1. 5:1. 5)， 避光反应4h，活化。分别称取Immol3肽，13肽，16肽，18肽，20肽溶入含有荧光染料罗丹明 B的ImlPBS缓冲液（Ph7. 4)中，室温避光搅拌过夜。反应结束后，反应液浓缩后通过葡聚 糖凝胶G-25柱，PBS缓冲液（Ph7. 4)作洗脱液，得到纯化的RhB-3,RhB-13,RhB-16,RhB-18 与RhB-20, -20°C储存备用。 将培养好的人脑胶质瘤U87MG细胞从12孔板上洗脱后重悬于PBS溶液，分别与罗 丹明B标记的3肽，13肽，16肽，18肽，20肽（500umol/L)共孵育2小时，并通过流式细胞 术检测其平均荧光强度，荧光强度越强证明对细胞的亲和力越强。使用相同浓度的罗丹明 B标记的环状RGD作为对照。 当探针与细胞上的受体亲和力强时，流式细胞仪检测出的细胞平均荧光强度值 高。体外亲和力实验结果显示相同量的标记了RhB的3肽，13肽，16肽，18肽，20肽与环状 RGD的探针分别与整合素受体高表达的U87MG细胞孵育后，在U87MG细胞中20肽探针平均 荧光强度为123,标记了环状RGD探针平均荧光强度为108,3肽的平均荧光强度为96,13肽 的平均荧光强度为30,16肽探针平均荧光强度为35,18肽探针平均荧光强度为43,空白染 料平均荧光强度为25,结果表明这些探针在与U87MG细胞亲和力强弱对比中，本专利技术20肽 的强度最大。 二、体外肿瘤细胞靶向实验 将人脑胶质瘤U87MG细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞分别在共聚焦皿中培养12 小时后，加入相同量的RhB-13，RhB-16，RhB-18，RhB-20共孵育，2小时后，吸弃培养液，并用 PBS缓冲液洗涤2-3次后在共聚焦显微镜下观察其荧光强度。 人脑胶质瘤U87MG细胞和人乳腺癌MDA-MB-231细胞为整合素受体高表达细胞，图 1显示了由RhB-20探针孵育的U87MG、MDA-MB-231细胞的共聚焦显微成像图。细胞成像结 果表明，RhB标记的多肽探针进入细胞后主要聚集在细胞质中，而不进当前第1页1&nb本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗肿瘤多肽，其具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：顾月清，张聪颖，刘雨溪，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。