一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将含有HD1R的包涵体用洗涤缓冲液多次洗涤、离心，溶解于强变性剂缓冲液中，得到粗分离的HD1R蛋白；2)将含有人胰岛素原变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，再用PBS、1mol/LNaCl或Tris、1mol/LNaCl的流动相B线等度洗脱，收集目标峰色谱馏分，得到复性与纯化后的HD1R的色谱馏分；3)将收集的目标峰色谱馏分直接进样，用20mmol/LPBS的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐，持续洗脱30min，洗脱流速为0.5-1.5ml/min，得到复性与纯化更高纯度和活性的色谱馏分；本发明专利技术方法工艺简单，可实现规模化生产，所得到的高产量和高纯度的馏分可为Notch信号途径的深入研究提供可靠的实验材料。
【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术属于生物技术中变性蛋白复性
，特别涉及一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，利用离子交换色谱及排阻色谱纯化与复性Notch配体Delta-like1融合蛋白。技术背景Notch因1916年Morgan在果蝇中发现部分突变可在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)而得名。Notch信号是通过局部细胞间的相互作用以控制细胞命运的一种途径，在进化中高度保守，广泛表达于胚胎和成年个体组织。该信号途径包括配体DSL(Delta/Serrate/Lag-2，DSL)、受体以及下游分子和调节分子组成。目前哺乳动物中已发现4种Notch受体蛋白，分别为Notch1-4；这些受体分子有5种配体，分别为Delta-like1、3、4和Jagged 1、2。这些受体/配体在结构上具有高度同源性，转录因子RBP-J(recombination binding protein-J，RBP-J)是哺乳动物Notch信号途径的主要核内效应物。当Notch的配体与受体结合后，触发三次酶切反应后释放NICD进入细胞核。进入细胞核的NICD通过RAM结构域与转录因子CSL(CBF1/Suppressor of Hairless/Lag-1，CSL)相互作用，使与CSL相结合的由SMR、SHARP、CIR和HDAC等分子所组成的转录共抑制复合物解离，并为之募集由GCN5、P300、SKIP和MAML1等分子组成的转录共激活复合物，使CSL由转录抑制转切换为转录激活，从而调节下游基因的表达。其中人Delta-like 1(Dll1)由723个氨基酸组成，为一次跨膜蛋白，其胞外段中有8个EGF样结构域和1个DSL基序。它可以和相同或不同的Notch受体结合，激活Notch信号通路，参与调控多种组织的生长发育，在造血细胞、胸腺细胞、骨髓间质细胞等表面均有表达，对诱导它们的分化中起重要作用。大肠杆菌(E.coli)作为基因工程蛋白生产最常用的表达体系，具有在快速表达的同时即可获得高密度重组蛋白的特点一直非常受人钦睐。但是，高效表达的目标蛋白质因缺乏翻译后的加工与修饰，常会以无活性、不溶性包涵体形式存在而限制了重组蛋白的应用。继稀释法、透析法、人工分子伴侣等体外辅助蛋白复性方法的出现，蛋白折叠液相色谱法(PFLC)法已经成为了一种更有效的蛋白复性与同时纯化方法。其中高效离子交换色谱法(HPIEC)利用不同蛋白质的带电部分与表面带有相反电荷固定相间吸附强弱不同，通过改变不同洗脱强度的流动相，进行吸附-解吸附-再吸附的复性，并同时被纯化，这种方法在大规模提纯蛋白上存在着潜在的优势[Wang CZ，et al，Appl Biochem Biotechnol2008；144：181-189]，利用弱阴离子交换柱DEAE-FF在3h内对重组人甲胎蛋白(rhAFP)复性与纯化，折叠产率比稀释法高9倍，纯度达95％[Chen Y，et al，J Chromatogr A.2009；1216：4877-4886]。通过对流动相中脲浓度、GSH/GSSG浓度比及pH等优化，用强阴离子交换实现了高纯度和质量回收率的重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)[Bai Q，et al，Biotechnol Prog，2007；23：1138-1142]。虽然，相比于离子交换色谱法，高专一性的亲和色谱对重组蛋白的纯化与复性能带来更高的纯度倍数，但是，除了固定相成本高这一缺点外，在对重组蛋白载体的构建时需要加入GST、His等纯化标签，复性完成后还要通过RPLC等方法将蛋白与纯化标签分离[Wilkinson RJ，et al，Protein Expres Purifi.2004；35：334-343]，过程繁琐，并不适用于大量生产。因此，在对重组蛋白的复性及纯化过程中，尤其是需要大规模生产时，如何在短周期、低成本的条件下获得大量高纯度的重组蛋白具有重要意义。
技术实现思路
为克服上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，它是可溶性人Notch受体的配体蛋白Dll1与RGD融合表达的产物，本专利技术用PFLC法，具体为阴离子交换色谱法及排阻色谱法对获得的包涵体进行了复性并同时纯化；该方法工艺简单，可实现规模化生产，得到的高产量和高纯度的馏分可为Notch信号途径的深入研究提供有效的实验工具。为实现上述目的，本专利技术中采用的技术方案是：一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，包括以下步骤：1)在大肠杆菌(E.coli)中表达的的菌体细胞经离心、超声波破碎、多次粗纯化后，溶解于8.0mol/L脲缓冲液中得到包涵体变性抽提液。2)将含有HD1R的包涵体用洗涤缓冲液多次洗涤、离心，溶解于强变性剂缓冲液中，得到粗分离的HD1R蛋白；3)将含有人HD1R蛋白变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，再用PBS、1mol/LNaCl或Tris、1mol/LNaCl的流动相B线等度洗脱，收集目标峰色谱馏分，得到复性与纯化后的HD1R的色谱馏分；4)将收集的目标峰色谱馏分直接进样，用20mmol/LPBS的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐，持续洗脱30min，洗脱流速为0.5-1.5ml/min，得到复性与纯化程度更高的活性色谱馏分。所述的色谱柱采用高效离子交换色谱柱可选HiTrap CaptoQ或HiTrap Capto DEAE，均为GE Healthcare公司生产的，规格为0.7×2.5cm，1mL，也可将DEAE填料自行填装至GE Healthcare公司生产的Column XK16内。所述的流动相A中PBS浓度为20-40mmol/L。所述的流动相A中PBS的pH为7.5-8.0。所述的流动相A中Tris的浓度为20-40mmol/L。所述的流动相A中Tris的pH为7.5-8.0。所述的流动相B中PBS浓度为20-40mmol/L。所述的流动相B中PBS的pH为6.0-7.0。所述的流动相B中Tris的浓度为20-40mmol/L。所述的流动相B中Tris的pH为7.5-8.0。所述的洗脱流速为0.5-1.5mL/min。所述持续洗脱的方式为流动相A平衡后，流动相B等度洗脱5-10min，延长10min。所述的进一步脱盐后的色谱柱为HiTrap Desalting column。本专利技术的有益本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Notch配体Delta‑like1融合蛋白的纯化与复性的方法，其特征在于，包括以下步骤：1)将含有HD1R的包涵体用洗涤缓冲液多次洗涤、离心，溶解于强变性剂缓冲液中，得到粗分离的HD1R蛋白；2)将含有人胰岛素原变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，再用PBS、1mol/LNaCl或Tris、1mol/LNaCl的流动相B线等度洗脱，收集目标峰色谱馏分，得到复性与纯化后的HD1R的色谱馏分；3)将收集的目标峰色谱馏分直接进样，用20mmol/LPBS的流动相平衡的色谱柱进一步脱盐，持续洗脱30min，洗脱流速为0.5‑1.5ml/min，得到复性与纯化更高纯度和活性的色谱馏分。
【技术特征摘要】
1.一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复性的方法，其特征在于，
包括以下步骤：
1)将含有HD1R的包涵体用洗涤缓冲液多次洗涤、离心，溶解于强变性剂
缓冲液中，得到粗分离的HD1R蛋白；
2)将含有人胰岛素原变性抽提液直接进样到流动相A平衡的色谱柱，再用
PBS、1mol/LNaCl或Tris、1mol/LNaCl的流动相B线等度洗脱，收集目标峰色
谱馏分，得到复性与纯化后的HD1R的色谱馏分；
3)将收集的目标峰色谱馏分直接进样，用20mmol/LPBS的流动相平衡的
色谱柱进一步脱盐，持续洗脱30min，洗脱流速为0.5-1.5ml/min，得到复性与纯
化更高纯度和活性的色谱馏分。
2.根据权利要求1所述的一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复
性的方法，其特征在于，所述的色谱柱采用高效离子交换色谱柱可选HiTrap
CaptoQ或HiTrap Capto DEAE，均为GE Healthcare公司生产的，规格为
0.7×2.5cm，1mL，也可将DEAE填料自行填装至GE Healthcare公司生产的
Column XK16内。
3.根据权利要求1所述的一种Notch配体Delta-like1融合蛋白的纯化与复
性的方法，其特征在于，所述的流动相A中PBS浓度为20-40mmol/L；所述的
流动相A中Tris的浓度为20-40mmol/L。
4.根据权利要求1所述的一种Notch配体Del...
【专利技术属性】
技术研发人员：张萍，韩骅，晏贤春，杨子岩，
申请(专利权)人：中国人民解放军第四军医大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61
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