D-二聚体质控品的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种检测药剂的制备方法，具体为D-二聚体质控品的制备方法，利用人血浆为原料，与酶复合溶液混合后，温育形成纤维蛋白凝块，用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，用缓冲溶液重悬纤维蛋白凝块，温育后，纤维蛋白凝块溶解，形成D-二聚体母液，用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，加入人正常混合血浆，制成不同浓度水平的D-二聚体质控品。该方法工艺简便快捷、成本低。采用人血浆为主要原料，直接制备纤维蛋白，纤维蛋白溶解过程尽可能接近人体内部自然的纤维蛋白溶解过程，从而获得性质结构和人体内部产物尽可能相似的产物，其性质与正常或疾病状态下，人体血液中的D-二聚体状态性质是一致的。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测药剂的制备方法，具体为D-二聚体质控品的制备方法。
技术介绍
目前临床常通过D-二聚体或FDP检测来发现血栓形成，从而帮助此类疾病的诊断。D-二聚体/FDP检测具有检测费用较低、结果返回时间短、特异性高、阴性预测值高的优点。在D-二聚体的检测中，由于检测标本的基质为人血浆，如果质控品的基质与人血浆相同或相似，将会避免因为基质不同而对检测结果的干扰，从而更好的监测实验方法的准确性和稳定性。通常用人血浆直接作为质控品用于常规疾病标志物的临床检测，但是由于正常人血浆中D-二聚体含量极低，不能反映某些疾病D-二聚体的高值状态，所以需要制备特定D-二聚体浓度的质控品。由希森美康株式会社申报的专利《D-二聚体测定用标准物质》申请号：20061009520.4，提供一种D-二聚体制备分离纯化方法，将纤维蛋白用分解纤维蛋白的酶溶解，并将获得的溶液用凝胶过滤层析，纯化出含有D-二聚体的溶液。适用于制备D-二聚体标准物质，由于标准物质的精密性和均匀性要求较高，使得制备技术复杂，需要复杂的纯化步骤。该方法使用的原料为市售商品或利用基因工程技术制备，成本高，过程复杂、耗时。以上这些因素使得该技术成本较高，不适合用于质控品的制备。由上海太阳生物技术有限公司提交的专利申请《D-二聚体质控品及其制备方法》申请号：201310090638.4，技术方案为将牛血浆复钙凝固后，加入可以降解纤维蛋白的酶使纤维蛋白凝块溶解，用蛋白酶抑制剂终止反应，产生的D-二聚体母液，用冻干保护液稀释，冷冻干燥，即得。该技术采用的主要原材料为牛血浆，虽然节约了成本，但是获得的D-二聚体物质毕竟是非人类的，异源性的，其基质的不同也可能会干扰检测结果，在一定程度上不能代表人体内部的真实状况，从而获得的检测结果也可能有一定的误差，影响临床结果的判断。
技术实现思路
针对上述技术问题，本专利技术提供一种简便、快捷的制备D-二聚体质控品的方法。本专利技术方法制备的D-二聚体质控品为D-二聚体多个浓度，且其他血浆物质含量与正常血浆相似或接近；该产品均一性和稳定性较好，满足临床对D-二聚体检测的质量控制要求，可以更准确地监测临床样本检测结果的准确性。具体的技术方案为：D-二聚体质控品的制备方法，包括以下步骤：(1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、纤维蛋白溶解酶激酶加入到缓冲液中，使其浓度依次分别为0.01～0.05mol/L、1～5U/ml、5～20mU/ml，得到的酶复合液在37℃温育10～15分钟；(2)制备纤维蛋白凝块：将多人份混合血浆在37℃温育5～10分钟，与温育的酶复合液混合，颠倒混匀，37℃温育，使其形成纤维蛋白凝块；(3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内的血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37℃温育0.5～2小时，纤维蛋白凝块溶解，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，以10000g，4℃离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液；(4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混合血浆中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值、分装、冷冻干燥，即得D-二聚体质控品。其中，缓冲液为可选择pH5～10、优选pH6～9的缓冲液，缓冲液为磷酸缓冲液、氨基酸缓冲液、咪唑缓冲液、GOOD缓冲液中的一种。GOOD缓冲液为MES、Bis-Tris、ADA、PIPES、TES、HEPES、Tris-HCl、TAPS缓冲液中一种。优选的缓冲液为Tris-HCl，Tris 0.05～0.15mol/L，氯化钠0.05～0.45mmol/L，pH7.2～7.8。冻干保护液：5～30g/L蔗糖、10～50g/L甘氨酸，1～10g/L叠氮化钠，5～25g/L4-羟乙基哌嗪乙磺酸，0.01～1.0g/L苯甲基磺酰氟。纤维蛋白溶解酶激酶为链激酶、组织型纤溶酶原激活物、尿纤溶酶原激活物中的任意一种。多人份混合血浆，是指由体格检查、血液生化检查、传染病检查均合格的健康人群血浆混合而成。丝氨酸蛋白酶抑制剂可以为苯甲基磺酰氟化物、苯甲脒、抑肽酶中任意一种，优选抑肽酶。抑肽酶浓度为1～10ug/ml。本专利技术提供的D-二聚体质控品的制备方法，利用人血浆为原料，与酶复合溶液混合后，温育一段时间形成纤维蛋白凝块，用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块后，用缓冲溶液重悬纤维蛋白凝块，温育一段时间后，纤维蛋白凝块溶解，形成D-二聚体母液。用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，加入多人份混合血浆与冻干保护剂，分装，冷冻干燥，制成不同浓度水平的D-二聚体质控品。本专利技术提供的D-二聚体质控品的制备方法，简化了传统方法的制备工艺，解决了多种酶需要分步骤添加的问题；同时解决了传统方法可选用酶较少、成本较高的问题，可以采用多种激活纤维蛋白溶解酶的酶，工艺简便快捷、成本低。采用人血浆为主要原料，直接制备纤维蛋白，从而获得D-二聚体溶液。纤维蛋白溶解过程尽可能接近人体内部自然的纤维蛋白溶解过程，从而获得性质结构和人体内部产物尽可能相似的产物。由于是利用人源化的材料制备质控品，其性质与正常或疾病状态下，人体血液中的D-二聚体状态性质是一致的。制备得到D-二聚体母液后，用缓冲液液加以稀释，加入到多人份混合血浆中，并添加冻干保护液，分装，冷冻干燥，从而制备得到D-二聚体质控品。该质控品除D-二聚体外，其中的其他物质的浓度水平与正常血浆相似或接近。具体实施方式结合实施例说明本专利技术的具体实施方式。实施例1D-二聚体质控品的制备方法，包括以下步骤：(1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、尿纤溶酶原激活物加入到缓冲液中，使其浓度依次分别为0.03mol/L、5U/ml、20mU/ml，得到的酶复合液在37℃温育10～15分钟；(2)制备纤维蛋白凝块：将多人份的混合血浆在37℃温育5～10分钟，与温育的酶复合液混合，颠倒混匀，37℃温育，使其形成纤维蛋白凝块；(3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内的血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37℃温育1小时，纤维蛋白凝块溶解，加入2ug/ml抑肽酶，以10000g，4℃离心15分钟，收集上清，即得到D-二聚体母液；(4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多人份混合血浆中，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，定值，分装、冷冻<本文档来自技高网...

【技术保护点】
D‑二聚体质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、纤维蛋白溶解酶激酶加入到缓冲液中，使其浓度依次分别为0.01～0.05mol/L、1～5U/ml、5～20mU/ml，得到的酶复合液在37℃温育10～15分钟；(2)制备纤维蛋白凝块：将多人份混合血浆在37℃温育5～10分钟，与温育的酶复合液混合，颠倒混匀，37℃温育，使其形成纤维蛋白凝块；(3)制备D‑二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝块内的血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37℃温育0.5～2小时，纤维蛋白凝块溶解，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，以10000g，4℃离心15分钟，收集上清，即得到D‑二聚体母液；(4)制备D‑二聚体质控品：用缓冲液调整D‑二聚体母液浓度，添加到多人份混合血浆中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D‑二聚体浓度，定值、分装、冷冻干燥，即得D‑二聚体质控品。

【技术特征摘要】
1.D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)制备酶复合液：将氯化钙、凝血酶、纤维蛋白溶解酶激酶加入到缓冲
液中，使其浓度依次分别为0.01～0.05mol/L、1～5U/ml、5～20mU/ml，得到的
酶复合液在37℃温育10～15分钟；
(2)制备纤维蛋白凝块：将多人份混合血浆在37℃温育5～10分钟，与温
育的酶复合液混合，颠倒混匀，37℃温育，使其形成纤维蛋白凝块；
(3)制备D-二聚体母液：用缓冲液洗涤纤维蛋白凝块，并挤干纤维蛋白凝
块内的血浆，然后用缓冲液将纤维蛋白凝块重悬，在37℃温育0.5～2小时，纤
维蛋白凝块溶解，加入丝氨酸蛋白酶抑制剂，以10000g，4℃离心15分钟，收
集上清，即得到D-二聚体母液；
(4)制备D-二聚体质控品：用缓冲液调整D-二聚体母液浓度，添加到多
人份混合血浆中，并加入冻干保护剂，用免疫比浊法测定质控品D-二聚体浓度，
定值、分装、冷冻干燥，即得D-二聚体质控品。
2.根据权利要求1所述的D-二聚体质控品的制备方法，其特征在于，所述
的缓冲液为pH5～10缓冲液，缓冲液为磷酸缓冲液、氨基酸缓冲液、咪唑缓冲
液、GOOD缓冲液中的一种。
3.根据权利要求2所述的D-二聚体...

【专利技术属性】
技术研发人员：苏娜，林方昭，谢兆林，喻洪跃，高翠华，
申请(专利权)人：中国医学科学院输血研究所，成都协和生物技术有限责任公司，
类型：发明
国别省市：四川;51