一株新型高产黑色素的菌株Streptomyces kathirae SC-1制造技术

本发明专利技术成功筛选到一株以酪氨酸为底物，生产黑色素的菌株，通过16S rRNA鉴定，发现该菌株与Streptomyces kathirae相似度最高，故将其命名为Streptomyces kathirae SC-1，与国内外已报道产黑色素链霉菌16Sr RNA进行对比，发现其最高相似度仅为95.37％，说明Streptomyces kathirae SC-1是一株新型产黑色素链霉菌，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2012432。对该菌株所产黑色素进行了光谱学鉴定，证明所产黑色物质为黑色素，发现该黑色素可以螯合Cu2+、Al3+、Fe3+，并且对Al3+的螯合作用尤其显著。因此，S.kathirae SC-1为一种新型产黑色素菌株。在种子培养基中活化后，接种于最优培养基中，28℃，200rpm的摇床上发酵5d，该菌株的黑色素产量可达到13.7g/L，达到领先水平。

【技术实现步骤摘要】
—株新型高产黑色素的菌株Streptomyces kathirae SC-1
从土壤中筛选黑色素高产菌株，属于生物工程中发酵
。 技术背景 随着有关人造黑色素的致癌、致病的报道不断增多，人们日益关注人造色素对人体造成的危害。人们对色素的生物安全性的关注度越来越高。天然的黑色素是非均质多酚类聚合体，以酪氨酸为底物，由酪氨酸酶催化后生成L-多巴、多巴铬等，而后经过一系列非酶催化的氧化反应最终生成黑色素。黑色素广泛存在于动植物和微生物中，与生物自我保护机制有关。有研究表明，天然的黑素色具有紫外吸收、抗氧化、清除自由基、螯合阳离子(例如有毒的重金属)、新型的药物载体、作为治疗某些与黑色素缺乏相关的神经系统疾病，例如着色性干皮病、帕金森氏症、老年性痴呆症、亨廷氏舞蹈病等，有报道指出，可溶性的黑色素在体外具有抗HIV的活性，为治疗艾滋病开辟了一个新途径。目前黑色素生产主要为动植物提取和采用化学法以酪氨酸为原料生产，这两种方法成本高、工艺繁琐，使黑色素因价格昂贵而限制其大规模的生产与应用。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶催化酪氨酸形成的多巴类黑色素，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色素的微生物种类繁多，生产工艺简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来生产黑色素具有巨大的优势。 本实验室从土壤中筛选到一株新型高产黑色素的链霉菌，并且对其进行进行了菌株鉴定，确定其为Streptomyces kathirae SC-1,与国内外已报道产黑色素链霉菌16SrRNA进行对比，发现其最高相似度仅为95.37%,说明Streptomyces kathirae SC-1是一株新型产黑色素链霉菌，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为:CCTCC M2012432，对其培养基进行了响应面优化，培养条件进行了优化，确定了该菌株产黑色素的最佳培养基及培养条件，在三角瓶中该菌的黑色素产量可达13.7g/L，达到国内领先水平，并且初步研究了该菌所产黑色素的理化性质，为微生物法生产黑色素进行了有益的探索。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株新型高产黑色素的菌株Streptomyces kathiraeSC-1，对其所产黑色素进行了理化性质的研究，并且通过响应面发确定了该菌发酵产黑色素的最适培养基，为该菌发酵产黑色素进行了有益的探索。微生物所产的黑色素是由其体内的酪氨酸酶催化酪氨酸生成，是氨基酸的衍生物，具有无毒、无害等特点，而且产黑色素的微生物种类繁多，生产工艺简单，易于操作，不受时间与地域的限制，因此用微生物来生产黑色素具有巨大的优势。 本专利技术的技术方案: 筛选方法:以土壤中筛选的菌株为出发菌株，通过分光光度法测定发酵液中黑色素的含量，筛选到一株能以酪氨酸为底物高产黑色素的菌株，通过16S rDNA鉴定，通过NCBI进行Blast对比，发现该菌株与Streptomyces kathirae相似度最高,故将其命名为Streptomyces kathirae SC_1,该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心,保藏编号为:2012432。而后对该菌株所产黑色素进行了光谱学鉴定，金属螯合研究。并且通过响应面发确定了该菌发酵产黑色素的最适培养基。 (I)目的菌株的筛选及鉴定 目的菌株的筛选:采用涂布平板法进行菌株的分离，将从自然界中采取的土样经无菌蒸馏水稀释后涂布于初筛培养基(葡萄糖1，蛋白胨10，NaCl 5, CaCl20.1,酪氨酸2，琼脂20，pH 6.0)，倒置于301:培养，2411后开始观察，每日一次，第5天结束。然后分离，纯化可以将初筛培养基染黑的菌株(如附图所示)，通过复筛后找到黑色素生产迅速且产量高的菌株。 产黑色素菌株的鉴定:菌株生理生化鉴定按照《链霉菌鉴定手册进行》；菌株16SrDNA经测序后通过NCBI进行blast对比，最终确定该菌分类。 (2)黑色素的提取、光谱学鉴定及金属螯合研究 黑色素的提取过程:采用酸化沉淀提取黑色素的方法.将发酵液离心，去菌体，上清液用6mol.L-1的HCl调pH值至2，静置过夜，使其充分沉淀，离心后得黑色素的粗提物；粗提物用Imol.Γ1的NaOH溶液充分溶解，离心后，将上清液再次用6mol.Γ1的HCl调pH值至2，静置4h离心得絮状沉淀物重悬于二次蒸馏水中，洗涤至中性后冷冻干燥；干粉在6mol.I/1的HCl中酸解4h后，依次在氯仿、乙酸乙酯、乙醇等有机溶剂中进行抽提，最后得到的固体物用二次蒸馏水清洗3次后，至于70°C的烘箱中24h，使其充分干燥，即为纯化的黑色素。 黑色素的紫外光谱:将少量的黑色素溶解于0.5mol.L4的NaOH溶液，在200-800nm的波长下进行紫外扫描。 黑色素的红外光谱:将l_2mg左右的黑色素与干燥的KBr混匀后充分研磨，压片后在谱域为4000?400CHT1的范围内进行黑色素的红外分光光谱测定。 黑色素的金属螯合:分别配置似+、1%2+413+、？63+、0&2+1112+、(:112+含量为1\101的适当浓度的、pH 8.0的黑色素溶液，在室温下放置011、2411后分别取样，5000印111离心101^11，在OD4tltl下测上清的吸光度。 (3)黑色素高产菌株的发酵优化 在几种备选的培养基进行该菌株黑色素的发酵，找到最适合的培养基作为发酵优化的初始培养基，在次培养基的基础上通过Plack-Burman实验,最陆爬坡实验，中心组合实验确定最优发酵培养基。 本专利技术的有益效果:以从土壤中筛选的菌株Streptomyces kathirae SC-1作为出发菌株，而该种菌株产黑色素的研究还未见报道。在种子培养基中活化后，接种于最优培养基中，28°C，200rpm的摇床上发酵5d后，通过标准曲线计算该菌株的黑色素产量可达到，13.7g/L，达到较高水平。此外，目前还没有利用S.kathirae发酵生产黑色素的相关报道，因此该菌株是一株新型的黑色素生产菌株。目前国内用微生物法发酵生产黑色素处于初级阶段，本专利技术为微生物法发酵生产黑色素进行了有益的探索。 【附图说明】 图1菌株在筛选培养基中产黑色素情况 具体实施方法 实施例1:菌株的筛选与鉴定 目的菌株的筛选:采用涂布平板法进行菌株的分离，将Ig土样倒入1ml的无菌蒸馏水中，置于摇床中30°C、150r/min摇30分钟，使其充分混匀，取出Iml倒入另外一只9ml的无菌蒸馏水中依次作10倍系列稀释，取200 μ I 10_5和10_6的稀释液涂布于初筛培养基(葡萄糖1，蛋白胨10，NaCl 5，CaCl20.1,酪氨酸2，pH 6.0)，每个稀释度涂布的平板为2个，倒置于30°C培养，24h后开始观察，每日一次，第5天结束。然后分离，纯化可以将初筛培养基染黑的菌株(如附图所示)，通过复筛后找到黑色素生产迅速且产量高的菌株。 产黑色素菌株的鉴定:菌株生理生化鉴定按照《链霉菌鉴定手册进行》；16SrDNA鉴定过程为:提取Streptomyces kathirae SC-1总DNA。使用通用引物(引物1:5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’、引物 2:5本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株产黑色素的链霉菌Streptomyces kathirae SC‑1，以酪氨酸为底物产黑色素，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2012432。

【技术特征摘要】
1.一株产黑色素的链霉菌Streptomyces kathirae SC_1,以酪氨酸为底物产黑色素，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC Μ 2012432。2.权利要求1所述的链霉菌菌株在生产黑色素的应用，挑取平板单菌落接种于种子培养基 g/L:葡萄糖 1，蛋白胨 10，NaCl 5，CaCl2 0.1，琼脂 20，pH 6.0,28。。，200rpm 的摇床培养...

【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，郭静，杨套伟，徐美娟，张显，满在伟，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32