用于生产葡萄糖聚合物和葡萄糖聚合物的水解产物的净化回路的方法技术

本发明专利技术涉及一种通过使用采用细胞系的炎症应答体外试验，用于确定生产步骤或纯化步骤对葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解产物中促炎污染分子的存在或性质的影响的方法。本发明专利技术进一步涉及一种生产或纯化葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解产物的优化方法，包括分析葡萄糖聚合物或葡萄糖聚合物的水解产物中的促炎污染分子以及选择相对于促炎污染分子的存在或性质被优化的生产或纯化步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于生产葡萄糖聚合物和葡萄糖聚合物的水解产物的净化回路的方法本专利技术涉及用于生产或纯化葡萄糖聚合物，更具体地是目的在于食品行业(富含纤维的健康成分)和医学领域(腹膜透析)的那些，或葡萄糖聚合物的水解产物，更具体地是目的在于医学领域(可注射的非热原性葡萄糖)的那些的净化回路的方法。专利技术的技术背景本申请公司已经选择在如下领域研发其专利技术，该领域因微生物来源的污染物能够在用于生产葡萄糖聚合物的回路中、或在用于生产其水解产物的那些回路中发展的风险而众所周知，所述污染物可能导致以下各项：-食物中毒，-对人类健康危害很大的炎症反应。因此在食品安全方法的背景下，如在健康安全方法的背景下，重要地是通过所有适当的技术手段，特别是通过以下各项来确保不存在处于活细胞形式和处于细胞碎片形式两者的微生物来源的污染物：-通过设置适当的纯化装置和技术限定安全生产回路，-用于有效鉴别和测定污染物的方法的限定。例如，在腹膜透析的情况下，必需在严格的净度条件下制备一定量的成分。腹膜透析事实上是一种类型的透析，它的目的是除去肾不能成功地或者不再能成功地从血浆纯化的废物，例如脲、肌酸酐、过量的钾或过剩水。这种医学处理适用于终末期慢性肾衰竭的情况。最常使用的透析液由在酸性pH(5.2-5.5)或生理pH(7.4)下的缓冲溶液(乳酸盐缓冲溶液或碳酸氢盐缓冲溶液)构成，向其中添加电解质(钠、钙、镁、氯)并且尤其是渗透剂(葡萄糖或葡萄糖聚合物，例如存在于由巴克斯特公司(Baxter)销售的流动腹膜透析液中的“艾考糊精(icodextrin)”)。作为渗透剂，葡萄糖聚合物，如上文提到的艾考糊精，相对于葡萄糖是优选的，原因在于快速跨过腹膜的葡萄糖因其小尺寸而导致在2至4小时的输注中渗透梯度的丧失。在将葡萄糖聚合物用于连续流动式腹膜透析的更具体领域中，非常快地变得明显的是，这些淀粉水解物(葡萄糖的混合物和葡萄糖低聚物和聚合物的混合物)不能够按照原样使用。欧洲专利申请EP207676传授在水中形成10％浓度的清澈和无色溶液的葡萄糖聚合物是优选的，所述葡萄糖聚合物具有5000至100000道尔顿的重均分子量(Mw)和小于8000道尔顿的数均分子量(Mn)。这类葡萄糖聚合物还优选地包含其分子量在5000和50000道尔顿之间的至少80％葡萄糖聚合物，很少或没有葡萄糖或葡萄糖聚合物，其中DP小于或等于3(分子量504)以及很少或没有葡萄糖聚合物，其中分子量大于100000(DP约600)。换言之，优选的葡萄糖聚合物是具有低多分散性指数(通过计算Mw/Mn比率所获得的值)的葡萄糖聚合物。在所述专利申请EP207676中建议的用于从淀粉水解物获得这些具有低多分散性指数的葡萄糖聚合物的方法在于：-用水混溶性溶剂进行麦芽糊精的分级沉淀，-或者通过拥有适当的截留或排除阈值的不同膜对相同麦芽糊精进行分子过滤。在这两种情况中，这些方法目的在于移除非常高分子量的聚合物以及低分子量单体或寡聚物两者。然而，就它们的实现方式而言并且就它们使可能获得的产品的产率和质量而言，这些方法并不令人满意。在有兴趣发展一种用于产生具有优选小于2.5的低多分散性指数、优选具有小于8000道尔顿的Mn、并且具有在12000和20000道尔顿之间的Mw的完全水溶性葡萄糖聚合物的方法中，所述方法没有现有技术的缺点，本申请公司在它的专利EP667356中努力解决此问题，通过从水解淀粉而非麦芽糊精开始。通过色谱分级所获得的葡萄糖聚合物则优选含有少于3％的葡萄糖和少于3％的具有小于或等于3的DP的葡萄糖聚合物，以及少于0.5％的具有大于600的DP的葡萄糖聚合物。这种葡萄糖聚合最终由腹膜透析领域的专家接受，在于因其渗透能力使用的这些葡萄糖聚合物是完全令人满意的。然而，微生物污染意在用于腹膜透析的这些制品的风险是令人痛惜的。事实上已知用于葡萄糖聚合物的生产回路可能受微生物或所述微生物中所含的促炎物质污染。例如淀粉工业中描述了玉米或小麦淀粉受酵母、霉菌以及细菌型微生物，并且更具体地受酸热脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidocaldarius)型的嗜酸热细菌(在回路的热区域以及酸性区域生长的嗜极性细菌)污染。接受这些污染产品的患者的主要风险则是腹膜炎。腹膜炎的这些发作是通过腹膜内细菌感染引起的，并且通过阳性透析液培养通常易于建立诊断。“无菌性腹膜炎”，其被描述为无菌、化学或培养物阴性腹膜炎，就其本身来说一般由化学刺激物或异物引起。自从引入艾考糊精用于制备腹膜透析液以来，已经报告了无菌性腹膜炎的孤立病例，这些病例可能与不同原因相关，并且特别由可能存在的促炎物质诱导。无菌炎性发作因此是注射透析液后所观察到的主要并发症。虽然这些炎性发作的某些与化学性质关联(意外注射化学污染物或某些化合物的不正确剂量)，但是大部分病例与用来制备透析液的溶液中出现的微生物源污染物存在直接相连。脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)是甚至以痕量存在时导致引发炎症的高风险的主要微生物源污染物。此外，本申请公司的荣誉在于也已经考虑到存在这样的分子，这些分子能够加重这些污染物，例如PGN解聚产物(其仍有生物活性的最少结构是胞壁酰二肽(MDP))引起的炎症应答。单独考虑时，这些衍生物在体外不是非常有炎性的并且针对大于1μg/ml的值给出显著应答。除PGN解聚产物之外，甲酰化微生物肽，其原型是f-MLP(甲酰基-Met-Leu-Phe三肽)，也具有实质性的协同活性。最初，这些肽因它们对白细胞的趋化剂活性而鉴定，尽管它们不能诱导细胞因子反应本身。因此重要的不是忽略这些“小分子”，因为它们可以通过加重痕量PGN和/或LPS的作用间接地引起无菌炎性发作。药典提出了如下一连串的用于检测热原性物质的测试：-用于检测是革兰氏阴性细菌的主要组分的细菌内毒素(LAL测试)，-兔热原测试。虽然总体上是可靠的，但是这两种测试具有它们的局限。兔热原测试是基于热原性物质的间接检测，通过测量注射含有这些物质的产品的兔的体温升高(发热反应)。如果不希望的物质具有太弱的生物活性或者浓度太低而不能诱导全身生热反应，此测试会产生假阴性。此外，此物质可能具有足以产生局部炎性反应的生物活性或浓度。LAL测试，就其本身而言，只检测细菌内毒素(LPS)以及还有β-葡聚糖，它们是真菌菌群的壁组分。未检测其他生物杂质(DNA、肽聚糖等)。因此对于某些情况，用含有艾考糊精的腹膜透析液观察到的无菌性腹膜炎的表现证明了一些物质可以逃过在药典中描述的测试并且可能造成不希望的临床效果的方式。为纠正此情况，BAXTER公司已经建议进行检测革兰氏阳性微生物污染物的努力。特别是，在它的专利EP1720999中，BAXTER公司提出特别是在用于制备腹膜透析液的葡萄糖聚合物中发展基于检测肽聚糖的方法，肽聚糖是革兰氏阳性菌细胞膜的主要组分。换言之，为防止出现这些无菌腹膜炎发作，BAXTER公司针对腹膜透析液的产生以及使用建议了一个将检测腹膜透析液中的肽聚糖的方案。此外，虽然在这一专利EP1720999中提到葡萄糖聚合物的上游处理，这一处理仅借助能够这样截留肽聚糖的亲和性树脂。因此没有预想以这样一种方式修饰用于生产葡萄糖聚合物的方法，该方式使最终产物不含有酸热环状脂肪酸芽孢杆菌型嗜酸热细菌的或本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于试验一个生产步骤或多个生产步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的影响或一个纯化步骤或多个纯化步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的效力的方法，该方法包括：a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物；b)任选地，检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子；c)对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个生产或纯化步骤；d)检测或测定步骤c)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子；e)确定步骤c)对这些促炎分子的存在或性质的效力或效果；其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验，该细胞系是巨噬细胞或巨噬细胞‑分化的细胞系，或是表达一种或多种TLR(Toll样受体)或NOD(含有核苷酸结合性寡聚结构域的蛋白)受体，例如，TLR2、TLR4或NOD2的细胞，并且使得检测该一个或多个受体、或其组合的应答成为可能。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2012.05.29 FR 1254935;2012.07.16 FR 1256848;2012.11.一种用于试验一个生产步骤或多个生产步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的影响或一个纯化步骤或多个纯化步骤对葡萄糖聚合物或其水解产物中促炎分子的存在或其性质的效力的方法，该方法包括：a)提供葡萄糖聚合物或其水解产物；b)检测或测定步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子；c)对步骤a)中提供的葡萄糖聚合物或其水解产物进行该一个或多个生产或纯化步骤；d)检测或测定步骤c)后获得的葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子；e)通过比较步骤b)和d)中检测或测定的、所述葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子，确定步骤c)对这些促炎分子的存在或性质的效力，促炎分子或这些分子中的一些的量的减少指示步骤c)的效力；其中用于检测或测定这些葡萄糖聚合物或其水解产物中的促炎分子的步骤包括使用细胞系进行的体外炎症应答试验，其中该体外炎症应答试验包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与以下各项相接触：a.表达TLR2受体和报告基因的细胞系，该报告基因的转录是在TLR2信号通路的直接控制下，通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子；和b.表达NOD2受体和报告基因的细胞系，该报告基因的转录是在NOD2信号通路的直接控制下，通过测量该报告基因的活性或信号来检测或测定这些促炎分子，其中所述促炎分子选自PGN(肽聚糖)、脂肽、PGN解聚产物和MDP(胞壁酰二肽)。2.如权利要求1中所述的方法，其中该体外炎症应答试验还包括使得这些葡萄糖聚合物或其水解产物与未经受免疫受体转染的对照系相接触。3.如权利要求1或2中所述的方法，其中该体外炎症应答试验还包括使得...

【专利技术属性】
技术研发人员：索菲亚·杜万特，赫拉·海新纳伽尔比，皮埃尔·拉诺，法布里斯·阿兰，马蒂厄·卡庞捷，安纳斯·丹伊斯，
申请(专利权)人：罗盖特兄弟公司，
类型：发明
国别省市：法国;FR