一种基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法技术

本发明专利技术是在使用TaqMan探针检测法的基础上，设计了高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合：Fp:5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’，Rp:5’-TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC-3’，MGB probe:5’-HEX/VIC-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB-3’；同时使用内参基因ACTB的引物及探针，将目的基因与内参基因加入一管中进行双通道荧光定量PCR反应，通过扩增曲线分析结果。本发明专利技术具有简便、灵活快速、特异性高、高通量、无污染、分辨率高等特点，适用于人体外周血、唾液中全基因组DNA样本的HLA-B*5801等位基因的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法
本专利技术属于药物基因组学和基因检测领域，具体涉及一种检测HLA‐B*5801等位基因的方法。
技术介绍
HLA是指人类白细胞抗原，由人类第6号染色体短臂一群密切连锁的复等位基因编码，由360万个碱基对组成，是当前已知的人类染色体中基因密度最高，也是多态性最为丰富的区域。主要包括HLA‐A、HLA‐B、HLA‐C、HLA‐DR、HLA‐DQ及HLA‐DP。世界卫生组织HLA因子命名委员会命名的相关HLA等位基因已达到5000多个；HLA基因的多态性决定了个体间表达的HLA蛋白分子不同，也决定了不同个体处理和呈递同一种抗原的能力不同，这是免疫应答诱导和调节的最基本点，从而使不同个体对同一种抗原的免疫应答可表现出个体差异。这种个体差异或产生保护性免疫，或形成免疫耐受,或出现自身免疫倾向，或表现为HLA相关疾病。如：HLA‐B*5801、HLA‐B*1502等位基因均与药物的过敏反应相关。因此，鉴于HLA系统的高度多态性和复杂性，决定了HLA等位基因的检测方法不同于普通多态性位点的检测。其中已有大量研究证明别嘌呤醇相关的严重超敏反应与白细胞抗原HLA‐B*5801密切相关，在服用别嘌呤醇后出现严重不良反应的患者中100％存在，而在未出现不良反应的患者(耐受人群)和正常对照组中，其携带率仅为15％和20％；，中国汉族、泰国人中HLA‐B*5801阳性者比白人高(6‐8％vs2％)，发生超敏反应的风险更大。别嘌醇(Allopurinol)为次黄嘌呤的异构体，是黄嘌呤氧化酶(XO)的抑制剂，可阻止次黄嘌呤和黄嘌呤代谢为尿酸，从而减少尿酸的生成，是目前唯一能抑制尿酸合成的药物，在高尿酸血症等症的治疗领域发挥着重要作用。临床主要用于：①原发性和继发性高尿酸血症，尤其是尿酸生成过多而引起的高尿酸血症；②反复发作或慢性痛风者；③痛风石；④尿酸性肾结石和(或)尿酸性肾病；⑤有肾功能不全的高尿酸血症。剂型为片剂。然而，随着药品的大量应用，其不良反应也日益凸显，是最易引起严重药疹的药物之一。别嘌醇的不良反应主要表现为皮肤、黏膜损害，最常见的是剥脱性皮炎，比较严重的有Stevens‐Johnson综合征、中毒性表皮坏死松解症、系统性疾病(嗜酸性粒细胞增多症、脉管炎、以及主要器官的疾病)。有文献报道别嘌呤醇皮肤变态反应致死率达20‐40％。临床上已经建议在使用别嘌呤醇前，应该进行HLA‐B*5801等位基因的检测，以判断是否属于高危人群，从而有效降低由别嘌呤醇引起的严重不良反应。同时，美国风湿病协会发布指南建议对具有高风险的别嘌呤醇过敏综合征的亚群体进行HLA‐B*5801检测。因此，研究一种快速、特异性高的PCR法对HLA‐B*5801等位基因进行检测是非常必要的。传统检测HLA等位基因分型检测的常用方法主要包括PCR‐SSOP(SequenceSpecificOligonucleotideProbes)和PCR‐SSP(Sequence‐specificprimers)，是基于核酸序列识别的方法，这些方法大多成本低、重复性好，然而需要多次的PCR后处理，即操作复杂，又容易发生污染而产生假性结果。PCR‐SBT(Sequence‐basedTyping)技术很大程度上弥补了PCR‐凝胶电泳技术的不足之处，可以精确地检测出样本是否携带HLA‐B*5801等位基因，此方法灵敏度高、特异性强，然而PCR‐SBT技术成本昂贵、耗时长、操作繁琐。基于实时定量TaqMan‐MGB探针及ARMS技术已成功应用于基因分型的检测，并显示了其突出的优势。首先，TaqMan‐MGB探针相对于普通的TaqMan探针而言，MGB探针的淬灭基团采用非荧光淬灭基团(Non‐FluorescentQuencher)，本身不产生荧光，可以大大降低本底信号的强度，同时探针上还连接有MGB(MinorGrooveBinder)修饰基团，可以将探针的Tm值提高10℃左右。因此为了获得同样的Tm值，MGB探针可以比TaqMan探针设计得更短，既降低了合成成本，也使得探针设计的成功率大大提高。此外，在模板DNA碱基组成不理想的情况下，短的探针比长的探针更容易设计，并且特异性更高，若一个碱基不配对，则MGB探针都不能与目的基因序列结合。其次，ARMS方法即扩增阻滞突变系统，这种技术的基本原理是在引物的3’端倒数第二位引入一个与模板序列不匹配的碱基，若引物最末端的碱基也与模板序列不互补，则不能延伸；若引物最末端的碱基与模板链互补，则在末端只有一个碱基不互补的情况下，引物可以进行延伸，这样就可以大大增加引物扩增的特异性。在进行样本检测时，只需将一个携带有HLA‐B*5801的样本作为对照(阳性质控品)，则可以很清楚地判断待测样本是否携带有HLA‐B*5801等位基因。然而，相对于HLA等位基因的检测，该技术至今很少应用于HLA‐B*5801等位基因的检测；其根本原因是多个HLA‐B等位基因与HLA‐B*5801具有很高的序列同源性(90％以上)，因而设计一套适宜于荧光PCR反应高特异性扩增HLA‐B*5801等位基因的引物探针组合十分困难。
技术实现思路
本申请研发出一套适宜于荧光PCR反应高特异性扩增HLA‐B*5801等位基因的引物探针组合；在现有的实时荧光PCR检测HLA分型的技术基础上，提供了一种更加简便、快速、高通量、特异性高的可以定性检测HLA‐B*5801等位基因分型的方法。该检测方法更易于在临床的推广和应用，从而更加有利于HLA‐B*5801基因型指导下的别嘌呤醇安全用药。本专利技术提供的定性HLA‐B*5801基因的TaqMan‐MGB探针检测方法，首先通过与HLA‐B中3000个其它等位基因序列的对比，进行HLA‐B*5801特异性位点和引物设计区域的确定，它们主要位于HLA‐B等位基因第2和第3外显子，然后根据特异性位点附近的区域，结合等位基因阻滞突变系统(ARMS)的方法，设计TaqMan‐MGB探针检测的特异性引物以及探针，值得注意的是探针和引物设计的位置能够排除其它HLA‐B等位基因的结合、识别，尤其是HLA‐B*570101等位基因。采用特异性更高的TaqMan‐MGB探针法在荧光定量PCR仪上扩增DNA片段，通过扩增曲线分析结果，来判断未知样本是否携带HLA‐B*5801等位基因。为实现以上专利技术目的，本专利技术的技术方案如下。本专利技术提出的用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合，包括：上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’；下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’；MGB探针：5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；其中，HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein。基于实时荧光PCR检测HLA-B*5801等位基因的方法，主要包括以下环节：(1)针对HLA‐B*5801等位基因设计特异性引物和探针，即权利要求1所述的引物探针组合；并设计内参基因的引物和探针；(2)获得抽提的待测样本基因组DNA；(3)在同一个反应体系中，将待测样本文档来自技高网...

【技术保护点】
用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA‑B*5801等位基因的引物探针组合，包括：上游引物Fp：5’‐AGGGGCCGGAGTATTGGGATG‐3’；下游引物Rp:5’‐TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC‐3’；MGB探针：5’‐HEX/VIC‐TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB‐3’；其中，HEX为6‐carboxy‐hexachlorofluorescein。

【技术特征摘要】
1.用于荧光PCR反应高特异性扩增HLA-B*5801等位基因的引物探针组合，其特征在于，包括：上游引物Fp：5’-AGGGGCCGGAGTATTGGGATG-3’；下游引物Rp:5’-TTGGCCTCAACTGAAAATGAAAC-3’；MGB探针：5’-HEX/VIC-TCAGGGAGGCGGATCTCGGAC–MGB-3’；其中，HEX为6-carboxy-hexachlorofluorescein。2.根据权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：康星，王会娟，陈融，刘金辉，戴鹏高，陈超，
申请(专利权)人：陕西佰美基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：陕西;61