一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用。一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌(Massilia sp.)Pn2，于2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927。利用该菌株制备的菌剂在实验室摇瓶培养条件下3d内对初始浓度为150mg·L‐1的菲降解率可达95％以上，同时该菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根处理将菌剂定殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的营养液中，能够在短时间内使植物体内的菲含量降低50％以上，显著降低了植物体的菲污染风险，且对植物生长有明显的促进作用。

【技术实现步骤摘要】
一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌及其应用
本专利技术属于环境多环芳烃(PAHs)污染生物修复领域，涉及一种具有PAHs降解功能的植物促生内生细菌及其生产的菌剂和应用。
技术介绍
多环芳烃(PAHs)是由2个或2个以上苯环组成的土壤环境中常见的一类重要持久性有机污染物，其疏水性强、难于降解。作为疏水性有机污染物，土壤中PAHs可被植物吸收并在体内积累。如何减低植物PAHs污染风险是当前农业环境领域研究的热点之一。植物内生细菌是指能够定殖在植物健康组织间隙或细胞内、并与宿主植物建立和谐共生关系的一类微生物，具有促进植物生长、增强宿主植物抗逆性、抗病虫害等作用，并可作为生防菌和外源基因的重要载体。然而，关于植物内生菌影响植物吸收有机污染物的报道至今仍很少。有研究表明，内生细菌可以提高有机污染土壤上植株的根长和生物量，增强植株对有机污染物的耐受性。而Barac等将利用基因改造过的内生细菌浸染黄色羽扇豆，发现通过植物叶片挥发的甲苯量减少50～70％。有学者推测筛选具有降解特性的植物内生菌并将其定殖在目标植物上，有望提高植物对有机污染物的降解作用，降低有机物在植物体内的积累，进而减低作物有机污染风险。然而，针对PAHs等持久性有机污染物，国内外仍少有资料报道，且未见相关专利研究和应用报道。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述技术问题，提供一种具有PAHs降解功能的植物促生内生细菌(以下简称功能内生细菌)。本专利技术的另一目的是提供该功能内生细菌生产的菌剂。本专利技术的又一目的是提供该功能内生细菌在降低植物PAHs污染风险中的应用。本专利技术的目的可通过以下技术方案实现：功能内生细菌马赛菌(Massiliasp.)Pn2，2014年5月21日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCCNo.1.12927，保藏地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，。一种用所述的马赛菌(Massiliasp.)Pn2所生产的功能内生细菌菌剂，是通过以下方法生产而成：1)将保藏编号为CGMCCNO.1.12927的马赛菌(Massiliasp.)Pn2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按5％(V/V，以培养基体积为基准，下同)的接种量接种入种子罐，培养至对数期；3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为200转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：胰蛋白胨0.5g·L-1，可溶性淀粉0.5g·L-1，葡萄糖0.5g·L-1，酵母膏0.5g·L-1，酪蛋白氨基酸0.5g·L-1，磷酸氢二钾0.3g·L-1，丙酮酸钠0.3g·L-1，七水合硫酸镁0.05g·L-1，pH7.0-7.4；5)发酵完成后培养液出罐，用发酵培养基调节培养液浓度至OD600nm＝0.55，即为功能内生细菌菌剂，可直接用于植物的浸根处理。所述的保藏编号为CGMCCNO.1.12927的马赛菌(Massiliasp.)Pn2在降解PAHs的应用；优选所述的马赛菌(Massiliasp.)Pn2在降解水体，土壤以及植物体内PAHs的应用。所述的多环芳烃(PAHs)选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。本专利技术所述的降解菌剂在降解多环芳烃中的应用；优选在降解水体，土壤或植物体内多环芳烃的应用。所述的多环芳烃优选自萘、苊、蒽、菲和芘中的任意一种或多种。有益效果本专利技术筛选获得一株马赛菌(Massiliasp.)Pn2(CGMCCNO.1.12927)，利用该菌株制备的功能内生细菌菌剂在实验室摇瓶培养条件下3d内对初始浓度为150mg·L-1的菲降解率可达95％以上,同时该菌可在不同程度上降解萘、苊、蒽和芘。利用浸根处理将该菌剂定殖于植物根表后将植物种植于受菲污染的营养液中，能够在短时间内使植物体内的菲含量降低50％以上，显著降低了植物体的菲污染风险，且对植物生长有明显的促进作用。本专利技术描述的环境修复菌剂可以用发酵工业通用发酵设备进行生产，具有生产成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合治理水体，土壤以及植物体内的PAHs污染。本专利技术为在PAHs污染区生产健康的农产品提供了技术支持，同时对于保障PAHs污染环境下的农产品安全具有重要意义。附图说明图1菌株Pn2的菌落照片和透射电镜照片A图为菌株Pn2的菌落照片，B图为菌株Pn2的透射电镜照片图2菌株Pn2以150mg·L-1菲为唯一碳源时的生长和降解曲线生物材料保藏信息功能内生细菌Pn2，分类命名为马赛菌(Massiliasp.)保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCCNO.1.129271，保藏日期为2014年5月21日。具体实施方式实施例1菌株的分离和鉴定将采自南京江宁扬子石化芳烃厂排污口的新鲜看麦娘植株进行表面消毒：植物用自来水冲洗干净后，于超净台内用75％酒精漂洗3～5min，而后用无菌水冲洗3～4次，再用1％次氯酸钠溶液漂洗2～5min，最后用无菌水再冲洗数次。将经表面消毒的植物样品移入LB固体平板上，于30℃培养24h后，检查平板上是否有细菌生长。若无菌落长出，则说明植株表面消毒成功。将经检验消毒完全的植株移入无菌研钵，用灭菌剪刀剪碎后，加无菌水充分研磨，取上清液以5％的接种量加入到100mL的无机盐培养基中，并添加菲至150mg·L‐1作为唯一碳源，于30℃，180r·min‐1摇床培养7d，以5％的接种量转接到相同的培养基中，连续转接三次后，梯度稀释富集液，取10‐4‐10‐7稀释度的富集液各0.1mL涂布于添加150mg·L‐1菲的无机盐平板上，于30℃恒温培养3d后，挑取长出的单菌落接种于含有150mg·L‐1菲的无机盐液体培养基中，于30℃，180rmin‐1摇床培养7d，验证其对菲的降解效果。无机盐培养基配方为：NH4NO31.0g·L‐1，KH2PO40.5g·L‐1，K2HPO41.5g·L‐1，NaCl1.0g·L‐1，MgSO4·7H2O0.2g·L‐1，pH7.0；固体培养基加16g·L‐1琼脂。降解效果的验证方法：向培养液中加入等体积色谱甲醇后，超声处理30min，使瓶中菲全部溶解，12000rmin‐1离心去除沉淀后取上清液用滤膜过滤(孔径0.22μm)，用高效液相色谱法测定其中的菲含量。高效液相色谱(岛津LC‐20AT，检测器型号SPD‐20A)设定参数为：InertsilODS‐SP‐C18反相色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇:水＝90:10，流速0.90mL·min‐1，柱温40℃，紫外检测波长245nm，进样量10μl。外标法按峰面积定量。从富集液中分离到一株菲降解菌，命名为菌株Pn2。菌株Pn2降解菲前后的液相色谱检测结果表明菌株Pn23d内对初始浓度为150mg·L‐1的菲降解率大于95％。菌株Pn2在固体培养基上生长3d后，菌落为圆形，表面光滑，边缘整齐，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌(Massilia sp.)Pn2，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC 1.12927。

【技术特征摘要】
1.一株具有多环芳烃降解功能的植物促生内生细菌马赛菌(Massiliasp.)Pn2，2014年8月26日保藏于中国微生物菌种保存管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC1.12927。2.一种用权利要求1所述的功能内生细菌马赛菌Pn2所生产的降解菌剂，其特征在于是通过以下方法生产而成：1)将保藏编号为CGMCC1.12927的马赛菌Pn2试管种接种于发酵培养基中，振荡培养至对数期；2)将上述培养好的菌种按5％的接种量接种入种子罐，培养至对数期；3)将种子液按10％的接种量接入生产罐培养；4)在种子罐和生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为200转/分，培养温度为30℃，全流程培养时间为55～60小时，发酵结束后菌体数量达到10亿个/ml以上；其中，所述的发酵培养基，种子罐所用的培养基和生产罐所用的培养基相同，配方均为：胰蛋白胨0.5g·L‐1，可溶性淀粉0.5g·L‐1，葡...

【专利技术属性】
技术研发人员：高彦征，刘娟，刘爽，孙凯，
申请(专利权)人：南京农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32