降解5环和6环多环芳烃的菌株及其获取方法、应用技术

本发明专利技术实施例提供了一种降解5环和6环多环芳烃的菌株、及其获取方法、应用，涉及环境污染物生物处理技术领域，可以高效地降解5环和6环多环芳烃。所述菌株名称为鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)ZH‑L8；形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为杆状；细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白色、不透明；生理生化特性为：细菌在20‑45℃范围内生长良好、在pH 5.7、6.8下生长良好；耐盐浓度为5％；甲基红阳性；接触酶阳性；v‑p阴性，v‑p液最终pH＜6；精氨酸利用阳性；硝酸盐利用阳性；D‑葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性等。

【技术实现步骤摘要】
降解5环和6环多环芳烃的新菌株及其获取方法、应用
本专利技术涉及环境污染物生物处理
，尤其涉及一种降解5环和6环多环芳 烃的新菌株及其获取方法、应用。
技术介绍
多环芳烃（PAHs)是一类广泛分布并稳定存在于自然环境中的含2个或2个以上 苯环的有毒有机污染物。由于其具有三致（致癌、致畸、致突变）效应，还会产生光致毒效 应，且其在土壤中具有隐弊性大、潜伏期长、涉及面广、治理困难等特点，尤其是高环PAHs， 不仅化学结构复杂、电子云密度高、很难被氧化，而且水溶性差、热稳定性强、固水分配系数 高、生物可利用性低，带来的环境污染问题日益突出，从而倍受环境科学家的关注，对人类 健康和生态环境具有很大的潜在危害。美国环保局在20世纪80年代初就将16种PAHs列 为环境中优先监测污染物，我国也将PAHs列入环境优先检测的污染物黑名单中。多环芳烃 已造成许多重点工矿企业内部和周边土壤的严重污染，在一些重工业污染区，每千克土壤 中PAHs含量可达上万微克。在农业污灌区同样存在污染问题，研究表明，沈抚灌区土壤表 层16种优先控制PAHs的平均含量达2. 22mg/kg，亚表层为0. 75mg/kg ;无论表层还是亚表 层，多环芳烃均以4环和5环为主，其在总PAHs中所占比例均在34%以上。 为了保护生态系统和人体健康，有必要对PAHs污染土壤进行修复。可采用的修复 方法包括物理法（如土壤蒸汽浸提、热脱附）、化学法（如化学氧化、土壤淋洗）、以及生物 法（如微生物修复、植物修复）。生物修复是指利用特定的生物吸收、转化、清除或降解环境 污染物，从而修复被污染环境或消除环境中污染物，实现环境净化。相对于物理修复和化学 修复还具有诸多优点，如费用低、效果好、不产生二次污染等，是一类低耗、高效和环境安全 的环境生物技术，具有良好发展潜力。因此，对多环芳烃污染的生物修复进行研究是非常具 有实际意义的。 微生物修复技术能有效的去除污染土壤中的低环PAHs，但可降解高环PAHs的 优势菌株很少，尤其五环以上则更少。迄今为止，学者们已经分离出许多可以降解多环芳 烃的微生物,其中细菌占主要地位。已经富集分离并鉴定的降解高环PAHs的细菌主要 包括：鞘氨醇菌属（Sphingomonas sp·)、假单胞菌属（Pseudomonas sp.)和分枝杆菌属 (Mycobacterium sp.)。其中，大多数降解菌能以四环PAHs为唯一碳源和能源生长，且可参 与更高环PAHs的共代谢降解过程。以往降解芳烃的细菌大多都是针对低分子量的多环芳 烃，对5环和6环多环芳烃的降解效果不甚理想，尤其针对以煤矿区PAHs污染的土壤为介 质的降解菌筛选工作尚未见有报道。因此，以河北唐山煤矿区PAHs污染的土壤为研究介 质，筛选5环和6环多环芳烃的高效降解菌，对于土壤PAHs污染的微生物修复具有重要的 现实意义。
技术实现思路
本专利技术的实施例提供一种降解5环和6环多环芳烃的新菌株、及其获取方法、应 用，可以高效地降解5环和6环多环芳烃。 为达到上述目的，本专利技术的实施例采用如下技术方案： -种降解5环和6环多环芳烃的新菌株，所述新菌株名称为：ZH_L8 ; 形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为 杆状；细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧 贴，白色、不透明； 生理生化特性为：细菌在20-45°C范围内生长良好、在pH 5. 7、6. 8下生长良好；耐 盐浓度为5%;甲基红阳性；接触酶阳性；v-p阴性，v-p液最终pH < 6 ;精氨酸利用阳性；硝 酸盐利用阳性；D-葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性；硝酸盐还原阳性； 卵黄卵磷脂酶阳性；酪氨酸水解阳性；柠檬酸盐利用阳性；D-甘露醇产酸、明胶液化阴性、 苯丙氨酸脱氢酶皆阴性；不产吲哚；兼性厌氧。 一种上述的新菌株的获取方法，包括以下步骤： (1)从唐山煤矿区周围的草地，按照梅花型取样方法取O-IOcm表层混合样1份，取 样完成后，在24小时内迅速进行下述步骤筛选出所述新菌株； (2)富集：取Ig所述混合样，采用无机盐液体培养基获得富集菌液，取ImL富集菌 液接种到LB培养基中进行培养； 其中，所述无机盐液体培养基包括：MgSO4. 7Η20 (λ 2g、CaCl2. 2Η20 (λ 02g、 FeSO4. 7H20 O.Olg、KH2PO4 0.4g、Na2HPO4 0.6g、MnSO4. H2O 0.02g NH4NO3 I. 0g、蒸馏水 IL ; 所述LB培养基：酵母浸提膏0. 5g胰蛋白胨lg、氯化钠 lg、琼脂I. 5-2g、pH7. 4-7. 6、蒸馏水 IOOml ； (3)筛选与纯化：将上述在LB培养基中培养后的富集菌液经含PAHs的无机盐培 养基进行筛选，并经多次转接纯化后，获得多株纯菌； (4)驯化：将已筛选出的所有纯菌接种到表层含120ug PAHs的无机盐固体培养 基中进行冲击，30°C下培养7d后观察菌落生长状况，得到目标降解菌株；所述无机盐固体 培养基包括：MgSO 4. 7H20 0· 2g、CaCl2. 2H20 0· 02g、FeSO4. 7H20 0· Olg、KH2PO4 0· 4g、Na2HPO4 0· 6g、MnS04. H2O 0· 02g NH4NO3 I. 0g、琼脂 15 ?20g、蒸馏水 IL ; 将所述目标降解菌株分别接种到含茚并芘、苯并[a]芘、二苯并[a，h]蒽、茚并茈 (Bghip)单体12ug、24ug、48ug的无机盐固体培养基中进行逐级驯化，3(TC下恒温培养7d 后，生长良好，将驯化后的菌株用甘油冷冻保存； (5)降解：将目标降解菌株接种至含茚并花、苯并[a]花、二苯并[a，h]蒽、茚并茈 (Bghip)单体的无机盐液体培养基中验证其降解能力，最后得到一株能够降解5环和6环 PAHs单体的高效降解菌株，将其命名为：ZH-L8。 一种上述的新菌株的应用，包括：所述新菌株用于降解5环和6环的多环芳烃。 上述技术方案提供的新菌株，及其获取方法、应用，通过采样、富集、筛选与纯化、 驯化、降解，获得新菌株，可以高效降解5环和6环多环芳烃，进而有效修复多环芳烃污染场 地。 新菌株：ZH-L8 拉丁文名：Acinetobacter baumannii (鲍氏不动杆菌） 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所 保藏日期：2014年08月11日 保藏编号：CGMCC NO. 9498 【附图说明】 图1为本专利技术实施例提供的一种新菌株在固体培养基上的形态示意图； 图2为本专利技术实施例提供的一种新菌株在显微镜下的形态示意图。 【具体实施方式】 下面将结合本专利技术实施例中的附图，对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完 整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于 本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种降解5环和6环多环芳烃的新菌株，其特征在于，所述新菌株名称为：ZH‑L8；形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为杆状；细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白色、不透明；生理生化特性为：细菌在20‑45℃范围内生长良好、在pH 5.7、6.8下生长良好；耐盐浓度为5％；甲基红阳性；接触酶阳性；v‑p阴性，v‑p液最终pH＜6；精氨酸利用阳性；硝酸盐利用阳性；D‑葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性；硝酸盐还原阳性；卵黄卵磷脂酶阳性；酪氨酸水解阳性；柠檬酸盐利用阳性；D‑甘露醇产酸、明胶液化阴性、苯丙氨酸脱氢酶皆阴性；不产吲哚；兼性厌氧。

【技术特征摘要】
1. 一种降解5环和6环多环芳烃的新菌株，其特征在于，所述新菌株名称为：ZH-L8 ; 形态特征为：固体培养基上生长呈圆形乳白色菌落，边缘光滑；显微镜下观察为杆状； 细胞呈革兰氏阳性杆状，侧面平行，两端钝圆；菌落圆形，边缘光滑，菌落与培养基紧贴，白 色、不透明； 生理生化特性为：细菌在20-45°C范围内生长良好、在pH 5. 7、6. 8下生长良好；耐盐浓 度为5%;甲基红阳性；接触酶阳性；v-p阴性，v-p液最终pH < 6 ;精氨酸利用阳性；硝酸盐 利用阳性；D-葡萄糖产酸、乳糖产酸、蔗糖产酸阳性；淀粉水解阳性；硝酸盐还原阳性；卵黄 卵磷脂酶阳性；酪氨酸水解阳性；柠檬酸盐利用阳性；D-甘露醇产酸、明胶液化阴性、苯丙 氨酸脱氢酶皆阴性；不产吲哚；兼性厌氧。2. -种权利要求1所述的新菌株的获取方法，其特征在于，包括以下步骤： (1) 从唐山煤矿区周围的林地，按照梅花型取样方法取〇-l〇cm表层混合样1份，取样完 成后，在24小时内迅速进行下述步骤筛选出所述新菌株； (2) 富集：取lg所述混合样，采用无机盐液体培养基获得富集菌液，取lmL富集菌液接 种到LB培养基中进行培养； 其中，所述无机盐液体培养基包括：MgS04. 7H20 0. 2g、CaCl2. 2H20 0. 02g、FeS04. 7H20 0? Olg、KH2P04 0? 4g、Na2HP04 0? 6g、MnS04. H20 0? 02g NH4N03 1. 0g、蒸馏水 1L ...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨志新，赵欧亚，李玉灵，冯圣东，石维，王伟，王小敏，李成，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13