一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法技术

本发明专利技术公开了一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，包括以下步骤：A)制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂；B)发酵培养；C)分离提取；从而制得A环降解物。本发明专利技术发酵制备A环降解物的方法，转化为无油条件，有效的抑制了A环，B环开环，进而抑制了其降解，提高了收率，重量收率可达到35～40％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种甾体激素重要中间体的制备方法，具体涉及一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法。
技术介绍
近代，有关使用微生物法转化植物甾醇制备甾体中间体的研究成果被广泛报道和研究，相关报道最早可追溯到1937年，Mamoli和Vercellone在他们发表的两篇专利Ber.70470和Ber.702079中，公开了通过酵母发酵将17-酮-类固醇还原成17-β-羟类固醇。此后，peterson和Murray在美国专利N0.2602769中公开一种用根霉属真菌产生孕酮的11-a-羟化方法。1972年，Kraychy等在美国专利N0.3684657中公开了用Mycobacterium SP.NRRL B-3683降解17位脂肪链制备4-AD,ADD的方法。1973年，Marsheck等在美国专利N0.3759791中公开了用Mycobacterium SP.NRRL B-3805，以胆甾烷等17位有8个以上碳原子的甾体原料制备4-AD。A环降解物(δ-Lactone)，是合成雌酚酮和雌二醇及其衍生物的重要中间体，但转化过程中甾核A环、B环开环，非常容易降解，产品难以积累，从而难以达到产业化标准。申请号为201410029845.3的中国专利申请公开了一种偶发分枝杆菌及在发酵生产δ-内酯中的应用，但发酵转化中用到大豆油，提取困难，且环境影响大。
技术实现思路
本专利技术涉及一种甾体激素重要中间体的制备方法，具体是一种植物甾醇经微生物转化为A环降解物的方法，本专利技术生产A环降解物中转化为无油条件，重量收率高，发酵效率高。为解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案实现：一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，包括以下步骤：A)制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂：a1)斜面种子培养：将偶发分枝杆菌接种到斜面种子培养基上，28～32℃培养3～5天；a2)一级种子培养：将a1中培养的菌落加入一级液体种子培养基中培养，培养的温度为28～32℃，培养的时间为45～50小时，培养的转速为180～200rpm；a3)二级种子培养：将a2中培养的菌液接种到二级液体种子培养基中培养，接种量为9～11％，培养的温度为28～32℃，培养的时间为22～25小时，得含偶发分枝杆菌的液体菌剂；B)发酵培养：将步骤A中得到的含偶发分枝杆菌的液体菌剂接种到转化培养基中培养转化，接种量为9～11％，培养转化的温度为28～32℃，培养转化的时间为95～100小时，培养转化的转速为200～250rpm，培养转化的空气流量为0.33～0.5vvm，培养转化的罐压为0.045～0.055MPa；C)分离提取：步骤B转化完全后，用浓硫酸调节pH值为1.9～2.1，然后用氯仿提取，浓缩，冷却，抽滤，滤饼层用甲苯冲洗，得A环降解物。进一步的，所述斜面种子培养基的配方为：酵母膏11～13g/L，硝酸钠6.3～6.4g/L，磷酸二氢钾0.9～1.1g/L，磷酸氢二钾1.9～2.1g/L，葡萄糖5.5～6.5g/L，氯化钾0.1～0.2g/L，七水硫酸镁0.7～0.9g/L，琼脂18～22g/L，pH为7.1～7.2。进一步的，所述一级液体种子培养基的配方为：玉米浆19～21g/L，硝酸钠6.3～6.4g/L，磷酸二氢钾0.9～1.1g/L，磷酸氢二钾1.9～2.1g/L，葡萄糖5.5～6.5g/L，氯化钾0.1～0.2g/L，七水硫酸镁0.7～0.9g/L，pH为7.1～7.2。进一步的，所述二级液体种子培养基的配方为：玉米浆19～2lg/L，硝酸钠6.3～6.4g/L，磷酸二氢钾0.9～1.1g/L，磷酸氢二钾1.9～2.1g/L，葡萄糖5.5～6.5g/L，氯化钾0.1～0.2g/L，七水硫酸镁0.7～0.9g/L，pH为7.1～7.2。进一步的，所述转化培养基的配方为：硝酸钠5.3～5.5g/L，磷酸氢二铵0.55～0.65g/L，玉米浆32～36g/L，吐温-80 0.4～0.6g/L，消泡剂0.2～0.3g/L，β-环糊精50～55g/L，植物甾醇19～22g/L，pH为8～8.4。进一步的，所述含偶发分枝杆菌的液体菌剂中，所述偶发分枝杆菌的菌体浓度达到10亿个/ml以上。本专利技术的发酵反应方程式为：与现在技术相比，本专利技术具有如下有益效果：本专利技术发酵制备A环降解物的方法，转化为无油条件，有效的抑制了A环，B环开环，进而抑制了其降解，提高了收率，重量收率可达到35～40％。具体实施方式下面结合具体实施例对本专利技术一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法作进一步的详细说明。实施例1含偶发分枝杆菌的液体菌剂的制备a1)斜面种子培养斜面种子培养基灭菌，冷却后接种偶发分枝杆菌，30℃培养3～5天。所述斜面种子培养基的配方如下：酵母膏12g/L，硝酸钠6.35g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，葡萄糖6g/L，氯化钾0.2g/L，七水硫酸镁0.8g/L，琼脂20g/L，调节pH值为7.1～7.2。a2)一级种子培养液体种子培养基灭菌，冷却至室温，把上述斜面种子培养的菌落加入一级液体种子培养基中培养，培养温度为30℃，培养转速为190rpm，培养时间为48小时。一级液体种子培养基的配方如下：玉米浆20g/L，硝酸钠6.35g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，葡萄糖6g/L，氯化钾0.2g/L，七水硫酸镁0.8g/L，调节pH值为7.1～7.2。a3)二级种子培养将一级种子培养后的菌液接种到二级液体种子培养基中培养，接种量为10％，培养温度为30℃，培养转速为190rpm，培养时间为24小时，得含偶发分枝杆菌的液体菌剂，所述偶发分枝杆菌的菌体浓度达到10亿个/ml以上。二级液体种子培养基的配方如下：玉米浆20g/L，硝酸钠6.35g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，葡萄糖6g/L，氯化钾0.2g/L，七水硫酸镁0.8g/L，调节pH值为7.1～7.2。发酵制备A环降解物1、检测二级种子培养后的菌株活性检测培养基灭菌；将待测试的液体菌剂(二级种子培养后的液体菌剂)接种到检测培养基中，接种量为5％，在转速为200rpm、温度为30℃下培养48小时。取样送液相检测，若其中A环降解物浓度大于5g/L，则二级种子培养后的液体菌剂合格，适于转化。检测培养本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，其特征在于，包括以下步骤：A)制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂：a1)斜面种子培养：将偶发分枝杆菌接种到斜面种子培养基上，28～32℃培养3～5天；a2)一级种子培养：将a1中培养的菌落加入一级液体种子培养基中培养，培养的温度为28～32℃，培养的时间为45～50小时，培养的转速为180～200rpm；a3)二级种子培养：将a2中培养的菌液接种到二级液体种子培养基中培养，接种量为9～11％，培养的温度为28～32℃，培养的时间为22～25小时，得含偶发分枝杆菌的液体菌剂；B)发酵培养：将步骤A中得到的含偶发分枝杆菌的液体菌剂接种到转化培养基中培养转化，接种量为9～11％，培养转化的温度为28～32℃，培养转化的时间为95～100小时，培养转化的转速为200～250rpm，培养转化的空气流量为0.33～0.5vvm，培养转化的罐压为0.045～0.055MPa；C)分离提取：步骤B转化完全后，用浓硫酸调节pH值为1.9～2.1，然后用氯仿提取，浓缩，冷却，抽滤，滤饼层用甲苯冲洗，得A环降解物。

【技术特征摘要】
1.一种发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，其特征在于，包括以下步
骤：
A)制备含偶发分枝杆菌的液体菌剂：
a1)斜面种子培养：将偶发分枝杆菌接种到斜面种子培养基上，28～
32℃培养3～5天；
a2)一级种子培养：将a1中培养的菌落加入一级液体种子培养基中
培养，培养的温度为28～32℃，培养的时间为45～50小时，培养的转速
为180～200rpm；
a3)二级种子培养：将a2中培养的菌液接种到二级液体种子培养基
中培养，接种量为9～11％，培养的温度为28～32℃，培养的时间为22～
25小时，得含偶发分枝杆菌的液体菌剂；
B)发酵培养：将步骤A中得到的含偶发分枝杆菌的液体菌剂接种到转化
培养基中培养转化，接种量为9～11％，培养转化的温度为28～32℃，培养转
化的时间为95～100小时，培养转化的转速为200～250rpm，培养转化的空气
流量为0.33～0.5vvm，培养转化的罐压为0.045～0.055MPa；
C)分离提取：步骤B转化完全后，用浓硫酸调节pH值为1.9～2.1，然
后用氯仿提取，浓缩，冷却，抽滤，滤饼层用甲苯冲洗，得A环降解物。
2.根据权利要求1所述的发酵植物甾醇生产A环降解物的方法，其特征
在于，所述斜面种子培养基的配方为：酵母膏11～13g/L，硝酸钠6.3～6.4g/L，
磷酸二氢钾0.9～1.1g/L，磷酸氢二钾1.9～2.1g/L，葡萄糖5.5～6.5g/L，氯化
钾0.1～0.2g/L，七水...

【专利技术属性】
技术研发人员：应正平，蒋青锋，陈小良，杨坤，
申请(专利权)人：江西赣亮医药原料有限公司，
类型：发明
国别省市：江西;36