一种温敏水凝胶微生物培养基及其制备方法技术

一种温敏水凝胶微生物培养基及其制备方法，该培养基由下述成分制成：壳聚糖1-5重量份，交联剂0-2重量份，温敏剂20-50重量份，微生物特异性显色剂0.2-0.4重量份，微生物鉴别培养基100重量份和pH调节剂调节pH值至7.0-7.2。该温敏水凝胶培养基在常温条件下(0-30℃)为液体，在生理温度或微生物培养温度(33-38℃)下，5-10min内能凝固成固体，其中加有微生物特异性显色剂，微生物培养过程中微生物特异性显色剂能使菌落显色，易于区分菌落和样品固态残渣，方便计数。壳聚糖原料丰富易得，价格便宜，制备的水凝胶培养基无毒、生物相容性好，能降解。

【技术实现步骤摘要】
一种温敏水凝胶微生物培养基及其制备方法
本专利技术涉及一种新型微生物培养基，具体涉及一种温敏水凝胶微生物培养基及其制备方法。
技术介绍
自20世纪40年代以来，有关水凝胶的理化性质、合成、在生物化学、医学应用领域的研究十分活跃(参见文献：翟茂林，哈鸿飞；水凝胶的合成、性质及应用，[J].大学化学，2001；16(5)：22-27)。水凝胶在水中能溶胀保持大量水分而又不溶解的交联聚合物，根据络合健的不同分为物理凝胶与化学凝胶，根据材料的不同又分为化学合成凝胶与天然高分子凝胶。天然高分子凝胶具有良好的生物相容性、对环境敏感性、丰富的原料和低廉的价格，因而正引起越来越多学者的重视。徐斌等研制的壳聚糖水凝胶，可用于组织工程化心肌的支架材料(参见文献：徐斌，段翠密，郝彤，等；壳聚糖水凝胶的研制及其与C2C12细胞粘附、支持作用的实验研究，[J].生物医学工程研究，2008；27(2)：122-124)。壳聚糖与磷酸甘油三钠按一定的比例混合，制成温敏性水凝胶，用于组织工程支架材料(参见文献：闫继红，孙海梅，尚宏伟，等；可注射性壳聚糖基温敏性凝胶的制备及其生物相容性，[J].吉林农业大学学报，2011；33(5)：522-526)。水凝胶的主要应用包括：日用品，作为一种高吸水性材料，广泛用于妇女卫生巾、儿童尿不湿、缓释型香精、纸巾等。工业用品主要用于溶剂脱水、金属离子浓集、空气过滤、废水处理等。农业土建上主要用于保水、污泥固化、水泥添加剂、绿化沙漠等。生物医学上主要用于烧伤涂敷物、药物传输、补齿材料、移植、隐型眼镜、细胞固化等。传统的固体及半固体微生物培养基是在培养基中加入凝固剂，如琼脂、明胶、硅胶等，其原料价格较贵。由于壳聚糖公知的抑菌功能，作为微生物培养基的应用尚未见报导。
技术实现思路
本专利技术的研究者意外地发现，当壳聚糖用作温敏水凝胶微生物培养基时，经培养的菌落数量和生长的速度与常规方法培养结果基本一致，进而研发了一种壳聚糖基温敏水凝胶微生物培养基及其制备工艺。为实现上述目的，本专利技术包括如下技术方案：一种温敏水凝胶微生物培养基，该培养基由下述成分制成：壳聚糖1-5重量份，交联剂0-2重量份，温敏剂20-50重量份，微生物特异性显色剂0.2-0.4重量份，微生物鉴别培养基100重量份和pH调节剂调节pH值为7.0-7.2。如上所述的温敏水凝胶微生物培养基，优选地，所述壳聚糖为N-脱乙酰度在70～90％的壳聚糖及其衍生物。如上所述的温敏水凝胶微生物培养基，优选地，所述交联剂选自聚乙烯醇、戊二醛和异丁醇中的至少一种。如上所述的温敏水凝胶微生物培养基，优选地，所述温敏剂选自α甘油磷酸钠、β甘油磷酸钠和无水甘油磷酸钠中的至少一种。如上所述的温敏水凝胶微生物培养基，优选地，所述微生物特异性显色剂为TTC指示剂、碘、三糖铁、磷钼酸、磷酸铋钾、甲基红、考马斯亮蓝G-250、七叶灵、5-溴-4-氯-3-吲哚-肌醇磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖吡喃糖苷酸、邻硝基酚β-D葡萄糖苷酸酶、丙烯乙二醇、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖吡喃糖苷酸、甲苯胺蓝、甲基绿、丫啶橙和5-溴-4-氯-3-吲哚-胸苷-3-磷酸中的至少一种。如上所述的温敏水凝胶微生物培养基，优选地，所述微生物鉴别培养基为营养肉汤培养液、酪素培养基、明胶培养基、淀粉培养基、H2S试验培养基、糖发酵培养基、远藤氏培养基或伊红美蓝培养基。如上所述的温敏水凝胶微生物培养基，优选地，所述磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、氯化铵、碳酸钠或碳酸氢钠。另一方面，本专利技术提供如上所述的温敏水凝胶微生物培养基的制备方法，该方法包括如下步骤：A.按照权利要求1所述成分和配比称取试剂，将各试剂和容器进行无菌处理；B.壳聚糖溶于微生物鉴别培养基中；在室温条件下往该培养基中加交联剂，持续搅拌下交联反应10-45分钟，形成清亮液体；C.在冰浴条件下往交联反应后的液体中逐滴加入温敏剂，搅拌30-60min至清亮溶液，加入微生物特异性显色剂，搅拌溶解，用pH调节剂调节体系pH值到7.0-7.2。再一方面，本专利技术提供一种温敏水凝胶微生物培养基，其是采用如上所述方法制备的。本专利技术的有益效果在于以下几个方面：1、温敏水凝胶培养基在常温条件下(0-30℃)为液体，在生理温度或微生物培养温度(33-38℃)下，5-10min内能凝固成固体，该特性在培养细菌方面的主要用途是分离纯化细菌，细菌在固化的培养基上长出菌落，分离纯化时挑出单个菌落即可。2、各组分分装前均经无菌处理，用于微生物培养可以直接使用，无需要再次灭菌，使用方便。3、加有微生物特异性显色剂，微生物培养过程中微生物特异性显色剂能使菌落显色，易于区分菌落和样品固态残渣，方便计数。4、壳聚糖原料丰富易得，制备的水凝胶培养基无毒、生物相容性好，能降解。而传统培养基的凝固剂原料紧缺价格高。具体实施方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明，以下所举实施例是为便于更好地理解本专利技术，但并不用来限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店或厂商购买得到。以下实施例、实验例中所使用的试剂来源为：壳聚糖，济南海得贝海洋生物工程有限公司生产，60目；甘油磷酸钠，阿法埃莎天津化学有限公司；营养肉汤培养液，北京陆桥技术责任有限公司；营养琼脂培养基，北京陆桥技术责任有限公司，批号20121123。实施例12g水溶性壳聚糖、45gβ甘油磷酸钠，经钴60辐射灭菌；0.3gTTC溶于30ml蒸馏水中，经0.45μm除菌滤膜过滤除菌，备用。取100ml经121℃高压灭菌20min的营养肉汤培养液，室温条件下先溶入2g水溶性壳聚糖，然后在25℃条件下往壳聚糖营养肉汤培养液中加交联剂聚乙烯醇0.8g，持续搅拌成清亮液体，逐滴加入戊二醛0.2ml，交联反应10min，形成清亮液体。在冰浴条件下往交联反应后的液体中逐步加入45gβ甘油磷酸钠，边加边搅拌45min至清亮溶液，然后加20mlTTC溶液，搅拌，用磷酸氢二钠饱和溶液调节体系pH值到7.1左右，混匀分装至无菌离心管中，每管20ml，即成温敏水凝胶培养基(一)。使用时按常规方法在培养皿中加1ml待培养样品，取一管温敏水凝胶培养基，倒入培养皿中，摇匀，放37℃孵箱中培养48h左右，有红色菌落显现，即可计数。实施例21.5g水溶性壳聚糖、30gβ甘油磷酸钠，经钴60辐射灭菌；0.3gTTC溶于30ml蒸馏水中，经0.45μm除菌滤膜过滤除菌，备用。取100ml经121℃高压灭菌20min的营养肉汤培养液，室温条件下先溶入1.5g水溶性壳聚糖，然后在25℃条件下往壳聚糖营养肉汤培养液中加交联剂聚乙烯醇0.4g，持续搅拌成清亮液体，交联反应40min，形成清亮液体。在冰浴条件下往交联反应后的液体中逐步加入30gβ甘油磷酸钠，边加边搅拌45min至清亮溶液，然后加20ml细菌指示剂TTC溶液，搅拌，用磷酸氢二钠饱和溶液调节体系pH值到7.1左右，混匀分装至无菌离心管中，每管20ml，即成温敏水凝胶培养基(二)。实施例34g水溶性壳聚糖、50gβ甘油磷酸钠，经钴60辐射灭菌；0.3gTTC溶于30ml蒸馏水中，经0.45μm除菌滤膜过滤除菌，备用。取100ml经12本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种温敏水凝胶微生物培养基，其特征在于，该培养基由下述成分制成：壳聚糖1‑5重量份，交联剂0‑2重量份，温敏剂20‑50重量份，微生物特异性显色剂0.2‑0.4重量份，微生物鉴别培养基100重量份和pH调节剂调节pH值为7.0‑7.2。

【技术特征摘要】
1.一种温敏水凝胶微生物培养基，其特征在于，该培养基由下述成分制成：壳聚糖1-5重量份，交联剂0.4-2重量份，温敏剂20-50重量份，微生物特异性显色剂0.2-0.4重量份，微生物鉴别培养基100重量份和pH调节剂调节pH值为7.0-7.2；其中，温敏剂选自α甘油磷酸钠、β甘油磷酸钠和无水甘油磷酸钠中的至少一种。2.如权利要求1所述的温敏水凝胶微生物培养基，其特征在于，所述壳聚糖为N-脱乙酰度在70～90％的壳聚糖及其衍生物。3.如权利要求1所述的温敏水凝胶微生物培养基，其特征在于，所述交联剂选自聚乙烯醇、戊二醛和异丁醇中的至少一种。4.如权利要求1所述的温敏水凝胶微生物培养基，其特征在于，所述微生物特异性显色剂为TTC指示剂、碘、三糖铁、磷钼酸、磷酸铋钾、甲基红、考马斯亮蓝G-250、七叶灵、5-溴-4-氯-3-吲哚-肌醇磷酸、5-溴-4-氯-3-吲哚-葡萄糖吡喃糖苷酸、邻硝基酚β-D葡萄糖苷酸酶、丙烯乙二醇、5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖吡喃糖苷酸、甲苯胺蓝、甲基绿、丫啶橙...

【专利技术属性】
技术研发人员：张维，陈春田，
申请(专利权)人：张维，陈春田，
类型：发明
国别省市：北京;11