本发明专利技术公开了一种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3-Ig融合蛋白，所述的融合蛋白包括Tim-3蛋白、人免疫球蛋白Ig片段及二者的连接序列。本发明专利技术通过人工合成方法获得人的Tim-3-Ig基因，构建了含Tim-3-Ig基因的表达载体，并对得到的融合蛋白进行了表达验证实验、结合活性实验、不同细胞系内的阻断活性实验及小鼠体内实验。本发明专利技术制备的人Tim-3-Ig融合蛋白可用于治疗由Tim-3高表达所导致的免疫疾病。
【技术实现步骤摘要】
—种能阻断Tim-3信号通路的人Tim-3融合蛋白
[0001 ] 本专利技术涉及一种融合蛋白，具体涉及一种人T im-3-1g融合蛋白及含有人Tim-3-1g融合蛋白的制剂，本专利技术还涉及人Tim-3-1g融合蛋白在治疗免疫疾病的用途。
技术介绍
Tim-3在结构上属于T细胞免疫球蛋白及粘蛋白(T cell Immunoglobulin domainand Mucin domain protein, Tim)家族成员。由于Tim家族广泛参与了机体的免疫调节过程，其功能正日益受到人们的重视。Tim-3特异性表达于活化的Thl、Thl7效应细胞表面，而不表达于Th2细胞。现已知半乳糖结合蛋白-9 (Galectin-9, Gal-9)为Tim_3的天然配体，该分子广泛表达于外周免疫系统，免疫调控分子Tim-3与其配体(Gal-9)结合后能通过一系列信号通路抑制免疫细胞，包括T细胞、天然免疫细胞如巨噬细胞等的活化，研究表明Tim-3在免疫细胞上的高表达与肿瘤、慢性病毒感染患者的免疫失能密切相关。研究还表明，任何阻断Tim-3 / Gal-9结合的因素均可以使Thl、Thl7细胞避开死亡，增强T效应细胞的活性，恢复免疫功能。 一方面，在一些自身免疫病如系统性红斑狼疮(SLE)、哮喘等疾病中，由于Gal-9或Tim-3表达的升高，导致Thl细胞的功能受到抑制，进而打破体内的免疫平衡，引起病理性的Th2细胞的活性增强，导致疾病的发病。在这种情况下，任何阻断Tim-3 / Gal-9结合的因素均能有利于体内免疫平衡的恢复，缓解疾病的进程。另一方面，在一些自身免疫病如炎性肠病以及I型糖尿病模型中，研究发现阻断Tim-3的活性增强了体内Thl效应细胞的功能，进一步加重了自身免疫损伤，该结果再次证明Tim-3在体内免疫平衡的维持中发挥重要作用。 上述研究资料表明，Tim-3通路具有重要的免疫调节功能，Tim-3表达的异常与多种疾病的发生、发展有密切关系。但是，目前并没有效果较好的Tim-3信号通路阻断剂。因此，提供一种特异性强、阻断效果好的Tim-3信号通路阻断剂，对某些疾病的发病机理研究、疾病诊断和治疗具有重要的意义。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术公开了一种--Μ-3-1g融合蛋白，所述融合蛋白具有良好的阻断效果。 在对Tim-3做修饰的分子,其分子量越大,越可能影响Tim_3和其配体的正确结合，从而影响其生物学活性。本专利技术创造性地提供一种Tim-3-1g融合蛋白，所述Tim-3片段是从Tim-3全长序列中优选出来的一段，所述Ig部分是从IgG的Fe序列中优选出来的一段，提高了 Tim-3-1g融合蛋白生物活性，同时降低成本，具有更高的实际应用价值。 本专利技术涉及用基因工程技术构建和生产能阻断Tim-3信号通路的蛋白质药物，制备方法以及这类药物在免疫疾病治疗上的应用。 本专利技术所述的TIM-3-1g融合蛋白为取人Tim-3的片段与人免疫球蛋白Ig片段融合后表达获得。 本专利技术所述的人免疫球蛋白Ig片段选自人IgG，IgM, IgE, IgA的Fe段或Fe段的部分序列，每种免疫球蛋白类型包括各亚型，如IgGl，IgG2，IgG3，IgG4，优选IgGl。 进一步，本专利技术优选人Tim-3的部分氨基酸片段与人免疫球蛋白IgGl部分氨基酸片段融合。更优选，人Tim-3的部分氨基酸片段与人免疫球蛋白IgGl的部分氨基酸片段融八口 ο [0011 ] 本专利技术提供人Tim-3的片段与人免疫球蛋白Ig片段融合后得到的具有阻断Tim-3抑制活性的融合蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID N0.1所示。 另外，如本领域技术人员所能预见到的，本专利技术的“人免疫球蛋白Ig部分”和“人Tim-3”还涵盖了具有相同或相似生物活性的所述多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):相对于所述多肽的氨基酸序列有若干个(较佳地1-10个,更佳为1-5个,最佳为1-3个)氨基酸的缺失、插入和/或取代。另外，所述缺失或插入(增加)也可发生在C末端和/或N末端(通常有20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内的氨基酸缺失或增加)。在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。提供功能相似氨基酸的保守性置换表是本领域所熟知的。下列5组各自含有能相互保守置换的氨基酸:脂族:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)；芳族:苯丙氨酸(F)、酪氨酸(Y)、色氨酸(W);含硫:甲硫氨酸(M)、半胱氨酸(C);碱性:精氨酸(R)、赖氨酸(K)、组氨酸(H);酸性:天冬氨酸(D)、谷氨酸(E)、天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)。另外，该术语还包括了 T细胞免疫球蛋白粘蛋白的片段或衍生物，较佳的是该片段或衍生物保留了所需的蛋白生物活性。 Tim-3片段与Ig片段之间经连接序列融合。 本专利技术所述的Tim-3-1g融合蛋白的Ig序列是通过接头(即连接肽)和Tim_3片段连接。所述接头可选择多种氨基酸，例如丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)和丝氨酸(Ser)或其它氨基酸的组合，例如可选择一系列的甘氨酸和丝氨酸的组合，长度约为10-15个氨基酸残基。最佳的连接肽长度和氨基酸组成取决于日常的实验情况。 本专利技术所述的Tim-3-1g融合蛋白的DNA序列如序列表SEQ ID N0.2所示。 应当理解，本领域技术人员可以根据密码子的兼并性以及在不同物种中的表达偏好，合成相应的核酸序列。这些变化也涵盖在本专利技术的范围之内。 融合蛋白质的构建技术基于分子克隆方法，具体实验方法可参考《分子克隆》第二版和第三版等实验手册。 用PCR合成的方法将编码有上述融合蛋白的DNA克隆到载体中。表达该融合蛋白的载体可以是分子生物学所常用的质粒。融合蛋白的氨基末端前可加上信号肽序列以保证蛋白质从细胞中分泌出来。载体序列中包括用于驱动基因表达的启动子，蛋白质翻译起始和终止信号，以及多聚腺苷酸(PolyA)序列。载体中有抗菌素抗性基因以利于质粒在细菌中所繁殖。另外，载体中还包括真核细胞选择性基因用于稳定转染细胞株的选择。 在完成质粒的构建以后，融合蛋白的DNA序列经测序证实。然后用质粒DNA转染细胞，表达相应的蛋白质。能够用于表达这些融合蛋白的表达系统有多种，它们包括，但不限于，哺乳动物细胞，细菌，酵母，昆虫细胞等等。 从哺乳动物细胞所表达的蛋白质具有糖基修饰，是表达Tim-3-1g融合蛋白的最佳细胞。可用于蛋白质大规模表达的哺乳动物细胞有多种，包括但不限于，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、海拉细胞、乳仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞(如Hep G2)和其它许多细胞系。 编码多肽的质粒可经转染(transfect1n)进入细胞。转染细胞的方法有多种，其中包括(但不限于):电钻孔(electroporat1n),脂质体(liposome)介导，钙介导等等。 除了哺乳动物细胞,其他表达系统也能用于这些融合蛋白的表达,例如细菌,酵母，昆虫细胞，等等，它们也包括在本专利技术所能使用的细胞范围。这些表达系统的蛋白质产量有可能比哺乳动物细胞为高，但这类表达系统所生产的蛋白本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种Ig融合蛋白，包括人Tim‑3蛋白和人免疫球蛋白Ig片段。
【技术特征摘要】
1.一种Ig融合蛋白，包括人Tim-3蛋白和人免疫球蛋白Ig片段。2.如权利要求1所述的一种Ig融合蛋白，其特征在于，所述免疫球蛋白Ig片段是Ig部分序列，Ig选自IgG，IgM, IgE, IgA，每种免疫球蛋白类型包括各亚型。3.如权利要求1-2任意一项所述的一种Ig融合蛋白，其特征在于,所述的Ig融合蛋白的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。4.如权利要求1-2任意一项所述的一种Ig融合蛋白，其特征在于,所述Ig融合蛋白的DNA序列如序列表中SEQ ID NO:2所示。5.一种含有权利要求4所述DNA分子的载体...
【专利技术属性】
技术研发人员：韩根成，陈国江，蒋兴伟，王仁喜，肖鹤，侯春梅，于佳卉，赵智，冯健男，黎燕，沈倍奋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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