本发明专利技术涉及分子生物学领域，具体地说是长牡蛎(Crassostrea gigas)溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)应激实验荧光定量内参基因的筛选。本发明专利技术筛选出18S rRNA与28S rRNA是在溶藻弧菌应激实验中，牡蛎血细胞内表达最稳定的一对内参基因。这对内参基因在溶藻弧菌应激实验中，表达的稳定性优于候选的另外的其他七个内参基因(包括常用的β-actin和Elongation factor-1α)，因此能为长牡蛎溶藻弧菌应激实验中获得功能基因表达的精确定量数据提供有力支持。
【技术实现步骤摘要】
长牡蛎溶藻弧菌应激实验荧光定量的内参基因及其引物和应用
本专利技术涉及分子生物学领域,具体地说是适用于长牡贩(Crassostreagigas)溶藻弧菌(Vibr1 alginolyticus)应激实验中进行功能基因表达分析的管家内参基因的筛选。
技术介绍
长牡贩(Crassostrea gigas),也称太平洋牡贩(Pacific oyster),属于瓣觸纲(Bivalvia),珍珠贝目(Pter1ida),牡贩科,是冠轮动物(Lophotrochozoa)中软体动物门(Mollusca)内的重要分支。其肉质肥嫩，鲜美可口，营养丰富，具有很高的经济价值，是世界上重要的水产养殖对象。自然分布于日本、中国和韩国，为世界性广布种。太平洋牡蛎作为贝类的“模式种”，一直受到科学家们的广泛关注，尤其是近来牡蛎基因组序列的破译引起更广泛的关注。长牡蛎天然免 疫系统一直是科学家们感兴趣的领域，开放的循环系统，每天都要面对潮间带各种病原菌的挑战，而牡蛎却能应付自如，其体内必然存在完备精细的天然免疫系统。病原菌及相关病原分子应激实验是近年来研究免疫基因对病原菌或相关分子响应机制的重要手段，研究者通过对牡蛎成体进行病原菌刺激，利用荧光实时定量PCR技术研究免疫基因随时间对病原菌的响应。本研究所选溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)由中国水产科学院黄海水产研究所莫照兰研究员提供，菌株编号YL1。溶藻弧菌属于弧菌科(Vibr1naceae),弧菌属(Vibr1)，是一种嗜盐性革兰氏阴性短杆菌。溶藻弧菌是一种常见的海洋致病菌，其数量居海水弧菌类之首，在世界各地海水及河口处分布广泛，能引起贝、鱼、虾、蟹等多种养殖动物的疾病，给各国水产养殖业造成巨大损失。因此溶藻弧菌受到广大贝类免疫系统研究者的关注，是病原菌应激实验常用到的一种菌株。荧光实时定量PCR(qRT-PCR)具有操作简单，成本较低，灵敏度高的优势，经常被用来研究目的基因的表达。一些对宿主对病原菌应激反应的研究，其转录水平的研究常常基于qRT-PCR实验。而相对荧光定量实验需要表达稳定的管家基因作为内参。管家基因是典型的组成性基因，在稳定或是病原应激的细胞中，管家基因都能相对较稳定表达。但是在不同的实验条件下，管家基因的表达量还是有差异的。因此确定稳定表达的管家内参基因对获得准确的qRT-PCR实验结果是非常重要的。
技术实现思路
本专利技术的目的是筛选长牡贩(Crassostrea gigas)溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)应激实验荧光定量的内参基因。即，基于荧光定量PCR中的相对定量法在长牡蛎溶藻弧菌应激实验中对免疫基因及其他功能基因进行定量分析所用的双基因荧光定量内参基因及其引物。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为:筛选出长牡蛎溶藻弧菌应激实验荧光定量的内参基因，其特征在于:长牡蛎溶藻弧菌应激实验中两个内参基因为18S rRNA,具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列和28S rRNA具有序列表SEQ ID No: 2中喊基序列。根据权利要求1所述的应用，其特征在于:所述贝类基因18S rRNA和28S rRNA在长牡蛎溶藻弧菌应激实验样品中稳定表达(即，表达量变化小)，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。根据权利要求1所述的应用，其特征在于:同时使用两个稳定表达的管家基因作为双基因内参；双基因内参的表达量Ct值为两个基因在应激实验样品中的表达量Ct值的算术平均数；通过该双基因内参校正上样过程中的实验误差，能够提高实验的准确性。根据权利要求1所述的应用，其特征在于:18S rRNA的特异性引物为:18S-F: 5，-TTGGTTTTCGGAACACGAGGTAAT-3，18S-R:5’ -TGCTTGGCAAATGCTTTCGCTG-3’，28S rRNA特异性引物为:28S-F: 5，-AAGGGCAGGAAAAGAAACTAAC-3，，28S-R: 5，-GTTTCCCTCTAAGTGGTTTCAC-3，具体步骤为:a.候选内参基因序列的获得:选取长牡蛎荧光定量PCR常用5个的内参基因Elongat1n factor-1α，β -actin,18S rRNA, 28S rRNA 和 Glyceraldehyde 3-phosphatedehydrogenase (GAPDH),以及在牡贩幼虫发育过程中表达稳定的内参Ribosomalprotein (RS18)和Ribosomal protein L7 (RL7),另外3个从牡贩基因组中获得的人的管家基因的同源基因 S-phase kinase-associated proteinl (SKPl), Heterogeneous nuclearribonucleoprotein Q (HNRQP)和 Ubiquitin-conjugating enzyme E2D2 (UBCDl)共 10 个基因作为内参基因的候选基因。b.引物设计:根据获得的候选基因序列设计该基因相应的特异引物(扩增产物单一，具体为溶解曲线峰单一，3%的琼脂糖胶检测条带单一)。c.PCR模板的准备:收集样品后，用TRIzol (试剂，市购于Life Technologies公司)提取总 RNA,用 PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(试剂盒，市购于TaKaRa公司)按照说明书反转成双链cDNA。作为荧光定量PCR的模板。d.荧光定量PCR反应:以反转的cDNA为模版，用内参基因相应的特异引物在ABI7500FAST real-time PCR仪中进行扩增。获得各个基因的表达数据Ct值。e.根据所得Ct值通过GeNorm v3.4软件计算，筛选出表达最稳定的内参管家基因并确定最优内参基因数目。本专利技术具有如下优点:1.本专利技术首次从多达十种候选内参基因中筛选出溶藻弧菌应激实验中表达最稳定的内参基因，数据真实可靠。2.筛选出的内参基因适用于长牡蛎溶藻弧菌应激实验中免疫相关基因或其他功能基因的表达分析，能显著提高所得数据的准确性。其应用较为普遍，操作相对简单，成本较低，灵敏度高，精确度高。3.本研究筛选出的的一对内参基因是经过严格的内参筛选程序选出的，是长牡蛎在溶藻弧菌应激条件下表达最稳定的内参基因。【附图说明】:图1.GeNorm软件计算出的各内参管家基因表达稳定值；图2.GeNorm通过成对变异系数(Vn/Vn+1)确定最适合的内参基因的数目。【具体实施方式】下面的实施例中将对本专利技术作进一步的阐述，但本专利技术不限于此。本专利技术所采用实验用品均来自市购，所用英文标记均为产品包装名称。>序列表⑴SEQ ID NOl的信息18S rRNA基因序列特征长度:1820bp类型:核酸 链型:双链拓扑结构:线形分子类型:DNA特性名称:18SrRNA来源:长牡蛎序列描述:牡蛎18S rRNA基因全长，基因编号AB064942TAACCTGGTTGATCCTGCCAGTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTACATACTCTTGCACAGTGAAACCGCGAA本文档来自技高网...
【技术保护点】
长牡蛎溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)应激实验荧光定量内参基因，其特征在于：长牡蛎溶藻弧菌应激实验中18S rRNA内参基因具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列和28S rRNA内参基因具有序列表SEQ ID No:2中碱基序列。
【技术特征摘要】
1.长牡贩溶藻弧菌(Vibr1alginolyticus)应激实验突光定量内参基因，其特征在于:长牡蛎溶藻弧菌应激实验中18S rRNA内参基因具有序列表SEQ ID No:1中碱基序列和28S rRNA内参基因具有序列表SEQ ID No: 2中喊基序列。2.—种权利要求1所述的应用，其特征在于:所述长牡蛎基因18S rRNA与28S rRNA在长牡蛎溶藻弧菌应激实验不同时间点取样样品中稳定表达(即表达量变化小)，能够在相对定量法实时荧光定量PCR中作为内参基因。3.—种权利要求1所述的应用，其特征在于:同时使用两个稳定表达的内参基因作为双基因内参；双基因内参的表达量Ct值为...
【专利技术属性】
技术研发人员：黄宝玉，张琳琳，李莉，张国范，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37
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