本发明专利技术提供了包含在SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:4的氨基酸序列中所示的艰难梭状芽胞杆菌(C.difficile)毒素A和毒素B的受体结合结构域的C-TAB.G5和C-TAB.G5.1分离多肽。所述C-TAB.G5和C-TAB.G5.1分离多肽可用于中和艰难梭状芽胞杆菌毒素A和/或毒素B的毒性作用。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】艰难梭状芽胞杆菌毒素A和毒素B蛋白的分离多肽及其用途专利
本专利技术涉及含有艰难梭状芽胞杆菌(Clostridium difficile)毒素A和毒素B的受体结合结构域的分离多肽及其作为疫苗的用途。这种分离多肽提供了对两种毒素的抗毒素免疫。专利技术背景艰难梭状芽胞杆菌是医院抗生素相关性腹泻的主要原因并且已经成为医院、疗养院和其它护理机构的主要健康问题。经估计医院的成本在欧洲为20亿美元，在美国为32亿美兀。病原体为革兰氏阳性、产孢厌氧细菌，在环境中常见但是也存在于2-3%健康成人群体的肠道中。艰难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)由正常结肠菌群的破坏引起，这通常是施用抗生素的结果。在暴露于环境中的艰难梭状芽胞杆菌孢子后，生物可定植于肠粘膜，在那里致病毒素的生成可导致CDAD。疾病范围可从轻度单纯性腹泻至重度假膜性结肠炎和中毒性巨结肠。CDAD已经在卫生保健机构中日益变得更成问题。最近研究报道，31%接受抗生素的住院患者变得有艰难梭状芽胞杆菌定植而56%变得有定植的那些患者继续发展CDAD。总的而言，艰难梭状芽胞杆菌是造成所有抗生素相关性腹泻的10-25%，50-75%抗生素相关结肠炎和90-100%抗生素相关假膜性结肠炎的原因。CDAD的治疗牵涉停止病因性抗生素，接着用甲硝咕唑(metronidazole)或万古霉素(vancomycin)治疗。停止抗生素治疗后在约20%的患者中出现复发，往往是艰难梭状芽胞杆菌再定植的结果。2003年，在加拿大魁北克的艰难梭状芽胞杆菌爆发表明出现了称为北美表现型1/027 (NAPl)，毒性更强的艰难梭状芽胞杆菌菌株。已经将NAPl与和先前菌株相比毒力更强、结果不好及发病率和死亡率更高联系起来。这种菌株的出现增加了在试图控制CDAD发生率中已经遇到的问题。用于预防复发性疾病的非达霉素(Fidaxomicin，DijiddG)是第一种新类别的窄谱型大环类抗生素药物(Revill, P.；SerradelI, N.；Bolos, J.(2006).^TiacumicinB:macrolide antibiotic treatment of C.difficile-associated diarrhea' Drugsof the Future31 (6):494 - 497)。它是从放线菌类(actinomycete)桔橙指孢囊菌(Dactylosporangium aurantiacum)亚种hamdenesis获得的发酵产物。非达霉素为非全身性，意味着其最低程度地吸收到血流中，具有杀菌性，并且已经展示出对病原艰难梭状芽胞杆菌的选择性根除，而对构成正常、健康肠道菌群的多个物种的细菌的破坏最小。在结肠中维持正常生理条件可降低艰难梭状芽胞杆菌感染复发的可能性(Johnson，Stuart(2009-06).Recurrent Clostridium difficile infection:a review of riskfactors, treatments, and outcomes'Journal of Infection58 (6): 403 - 410)。尽管认为引入这种新 类别的抗生素药物会改善对CDAD的治疗，但是尤其是对高危患者例如老年和免疫低下患者而言，仍存在对预防性药物的医疗需求。 CDAD是艰难梭状芽胞杆菌生成的两种外毒素,毒素A和毒素B (也分别称为CTA和CTB)的作用结果。两种毒素均为具有多个功能结构域的高分子量(~300kDa)分泌蛋白(Voth DE 和 Ballard JD, Clinical Microbiology Reviewsl8:247-263 (2005))。两种毒素的N末端结构域含有修饰Rho样GTP酶的ADP葡萄糖基转移酶活性。这种修饰导致失去了肌动蛋白聚合和细胞骨架变化，导致结肠上皮紧密连接破坏。这导致过量液体渗入结肠和引起的腹泻。中央结构域含有疏水性结构域并且预测牵涉膜转运。两种毒素的C末端结构域含有称为重复单元(RU)的多个同源区域，其牵涉毒素与靶细胞的结合(Ho等，PNAS102:18373-18378 (2005)) ?重复单元分类为短(21-30个氨基酸)或长(~50个氨基酸)重复单元。重复单元组合形成聚簇，每个通常含一个长重复单元和3-5个短重复单元。全长毒素A具有39个组织成8个聚簇的重复单元(ARU) (Dove等Infect.1mmun.58:480-488 (1990))，而全长毒素B含24个组织成5个聚簇的重复单兀(BRU)(Barroso 等，Nucleic Acids Res.18:4004(1990) ；Eichel-Streiber 等，Gene96:107-113(1992))。来自动物模型和临床的许多研究已经表明抗毒素抗体在防护艰难梭状芽胞杆菌相关疾病中的作用。经福尔马林(formalin)灭活毒素A和毒素B免疫的仓鼠产生高水平的抗毒素抗体并且受保护免受艰难梭状芽胞杆菌的致死性攻毒(Giannasca PJ和Warny M，Vaccine22:848-856 (2004))。另外，被动转运小鼠抗毒素抗体以剂量依赖方式保护仓鼠。Kyne L等(The Lancet357:189-193 (2001))报道，CDAD首次发作期间抗毒素A抗体反应的发展与对疾病复发的防护相关。保护性抗毒素抗体识别的决定簇已经定位于含有起受体结合结构域作用的重复单位的 C 末端结构域中。最初,Lyerly 等(Current Microbiology21:29-32 (1990))透露，含33个重复单元的毒素A C末端结构域能够诱导中和抗毒素抗体的生成并且可防止艰难梭状芽胞杆菌感染。在这项研究中，用细菌攻毒之前，仓鼠皮下注射纯化重组多肽多次，然而仅实现部分保护。另一项研究(Ryan等，Infect.1mmun.65:2941-49(1997))显示,含有来自CTA的C末端的720个氨基酸残基和大肠杆菌(E.coli)溶血素A(在霍乱弧菌(Vibriocholerae)中表达)的分泌信号的分离多肽在兔CDAD模型中诱导对小剂量CTA的保护性全身和粘膜免疫。还有报道称，对毒素A和B的C末端结构域的抗体反应是实现全面保护所必需的(Kink 和 Williams, Infect.1mmun.66:2018-25(1998)，美国专利 N0.5，736，139(1998))。这项研究揭示，每种毒素的C末端结构域在生成毒素中和抗体中最有效。证明了经口递送的对CTA和CTB的C末端结构域产生的禽类抗体(抗毒素)在仓鼠致死模型中的有效性。结果还表明，抗毒素可能在人类CDAD的治疗和管理中有效。在另一项研究中，报道人抗毒素A和B单克隆抗体赋予了对艰难梭状芽胞杆菌诱导的仓鼠死亡率的防护(Babcock等，Infect.1mmun.74:6339-6347 (2006))。仅用对抗任一毒素的受体结合结构域的抗体观察到保护并且在用抗毒素A和B抗体治疗后观察到保护增强。另一方面，Ward等(Infect.1mmun.67:5124-32 (1999))考虑到来自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的14个重复单元(14CTA)以研究佐剂活性。克隆重复本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，其包含与SEQ ID NO:4中所示的氨基酸序列具有至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选99%序列同一性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种多肽，其包含与SEQ ID N0:4中所示的氨基酸序列具有至少85%，更优选至少90%，甚至更优选至少95%，最优选99%序列同一性的氨基酸序列。2.根据权利要求1所述的多肽，其中接种所述多肽的仓鼠历经在所有孢子剂量下(102、103和IO4)灌胃施用致死剂量的艰难梭状芽胞杆菌孢子而存活。3.根据权利要求1或根据权利要求2所述的多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素A的C末端结构域的19个重复单元。4.根据权利要求1至3中任一项所述的多肽，其中所述多肽包含源自艰难梭状芽胞杆菌毒素B的C末端结构域的23、33或47个重复单元。5.根据权利要求1至4中任一项所述的多肽，其中所述多肽选自SEQID:2、SEQ IDNO:4,SEQ ID N0.18,SEQ ID N0:20 和与 SEQ ID:2,SEQ ID NO:4,SEQ ID N0.18 或 SEQ IDNO:20中任一个95%同一的多肽。6.根据权利要求1至5中任一项所述的多肽，其中所述多肽是分离的。7.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于药物中。8.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于预防和治疗难梭状芽胞杆菌相关疾病(CDAD)。9.根据权利要求1至6中任一项所述的多肽，其用于预防有CDAD风险的受试者的CDAD。10.根...
【专利技术属性】
技术研发人员：L埃林斯沃思，D弗莱耶，JH田，S富尔曼，S克利普费尔斯塔尔，G格伦，K韦斯特里施尼希，
申请(专利权)人：瓦尔内瓦奥地利有限责任公司，因特塞尔美国有限公司，
类型：发明
国别省市：奥地利;AT
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