灭活的SARS-CoV-2病毒疫苗制造技术

本文描述了SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】灭活的SARS
‑
CoV
‑
2病毒疫苗


[0001]本专利技术涉及SARS
‑
CoV
‑
2疫苗以及用于生产所述疫苗并向受试者施用疫苗以产生抗SARS
‑
CoV
‑
2免疫应答的组合物和方法。

技术介绍

[0002]SARS
‑
CoV
‑
2(以下简称“病毒”)的自然宿主是蝙蝠，并且该病毒属于冠状病毒科Betacoronavirus(betaCoV)属。该病毒的ssRNA基因组为29,903bp(Wuhan
‑
Hu
‑
1:GenBank参考序列：NC_045512.2)，编码9860个氨基酸、25个非结构蛋白和4个结构蛋白：尖峰(S)蛋白、包膜(E)蛋白、膜(M)蛋白、核衣壳(N)蛋白。该病毒具有60至140纳米直径的可变大小。它被包膜，并对紫外线、热和脂质溶剂敏感。它与蝙蝠SARS
‑
样
‑
CoVZXC21具有89％的核苷酸一致性，并与人SARS
‑
CoV具有81％的核苷酸一致性。有证据表明，当感染者咳嗽时，携带病毒的小滴进入空气中，这种病毒就会传播。这些细菌可以被吸入，如果接触到它们降落的表面，然后接触到眼睛、鼻子或嘴巴，就会引起感染。此外，可能存在其他载体，病毒可能通过输血、胎盘传播和性传播传播。虽然SARS
‑
CoV
‑
2病毒感染的症状可能很轻微，通常包括发烧和咳嗽，但也可能是无症状的，或者是致命的。主要症状通常是高温、咳嗽和呼吸困难。目前没有针对这种病毒的特定治疗或疫苗，唯一的预防方法是社交距离。SARS
‑
CoV
‑
2对公众健康构成重大威胁。帝国理工学院COVID
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19(SARS
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CoV
‑
2引起的疾病)应对小组于2020年3月16日发布了一份报告，其中他们评估了所有可能的方法，以阻止或延迟病毒传播，最终导致医疗系统崩溃，仅在英国就有数十万人死亡。他们指出，只有全人口范围的社会距离才有可能将影响降低到可控制的水平。在疫苗问世之前，这些措施必须得到坚持。这项建议将意味着对大多数人口进行至少18个月的隔离。他们得出结论，除了愿意牺牲老年人，大规模生产疫苗是阻止这一流行病的唯一选择。鉴于这种戏剧性的情况，绝对迫切需要尽快研制出有效的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗。此外，出现了各种逃逸突变体(如英国_B.1.1.7；南非_B.1.351；巴西_P.1变体以及加州变体B.1.427和B.1.429；也见图2)，这进一步恶化了局势，因此这一不幸的发展也需要得到解决。

技术实现思路

[0003]因此，本专利技术提供一种灭活的SARS
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CoV
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2疫苗。虽然世界各地的研究小组已经投入了大量精力开发SARS
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CoV
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2疫苗，但大多数方法都集中在亚单位疫苗(例如编码SARS
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CoV
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2S蛋白或其片段)、减毒活疫苗或编码病毒蛋白的重组DNA或RNA疫苗。然而，人们对全病毒灭活疫苗方法兴趣不大，成功的SARS
‑
CoV
‑
2灭活疫苗尚未完全开发。就灭活疫苗方法而言，在标准条件下使用典型的灭活剂(如甲醛)和佐剂(如明矾)可存在阻碍开发有效候选疫苗的缺点。此外，这种候选疫苗可导致SARS
‑
CoV
‑
2疾病和/或Th2型免疫病理学的抗体依赖性增强(ADE)，这可是由对SARS
‑
CoV
‑
2成分的超敏反应引起的。本专利技术旨在解决这些问题，从而生产安全有效的全病毒灭活的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，该疫苗克服了现有技术的缺点。
[0004]因此，在本专利技术的一个方面提供一种包含β
‑
丙内酯灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的
SARS
‑
CoV
‑
2疫苗；其中所述疫苗能够在人类受试者中产生针对天然SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的中和抗体。优选地所述SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的天然表面构象保存在所述疫苗中。
[0005]在另一方面，本专利技术提供了一种SARS
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CoV
‑
2疫苗，包含灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒；其中所述SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的天然表面构象保存在所述疫苗中，使得所述疫苗能够在人类受试者中产生针对天然SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的中和抗体和/或其他免疫应答，能够部分或完全保护50％以上、优选60％以上、70％以上、80％以上和90％以上的所述接种的人类受试者。
[0006]特别是，本专利技术旨在提供最佳灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒，其不能复制和感染人类细胞，但保留病毒表面蛋白的免疫原性表位，因此适合于在接种受试者中产生保护性免疫。通过优化灭活过程和疫苗生产中的其他步骤，包括选择合适的佐剂，可以获得一种新的疫苗组合物，其保留SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的天然表面构象，并降低不良反应(如ADE和免疫病理学)的风险。下面更详细地描述这种疫苗组合物。
[0007]在另一个具体实施方案中，本专利技术旨在提供最佳灭活的不同SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的最佳组合，这些颗粒不能复制和感染人类细胞，但保留病毒表面蛋白的免疫原性表位，因此适合于在接种受试者中产生保护性免疫。通过不同和最佳灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的最佳组合，可以获得改进的疫苗组合物，其能够在人类受试者中产生针对天然SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的中和抗体和/或其他免疫应答，能够部分或完全保护50％以上、优选60％以上、70％以上、80％以上和90％以上的所述接种的人类受试者。
[0008]本专利技术的每个限制可以包括本专利技术的各种实施例。因此，预期涉及任何一个元件或元件组合的本专利技术的每个限制可以包括在本专利技术的各个方面中。本专利技术的应用不限于以下描述或附图中所示的构件的构造和布置细节。本专利技术能够以各种方式实施或实施其它实施例。
附图说明
[0009]附图并非按比例绘制。附图仅是说明性的，并且不需要用于实现本公开。为清晰起见，并非每个部件都可以在每个图纸中标记。在附图中：
[0010]图1.本专利技术灭活的SARS<本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.一种包含β
‑
丙内酯灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述疫苗能够在人类受试者中产生针对天然SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的中和抗体。2.根据权利要求1所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的天然表面构象保存在所述疫苗中。3.根据权利要求1或2所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒中的病毒RNA是复制缺陷的，优选地其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒中的病毒RNA：(i)被烷基化和/或酰化；(ii)包含一种或多种修饰的嘌呤(优选鸟嘌呤)残基和/或链断裂；和/或(iii)与一种或多种病毒蛋白质交联。4.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述SARS
‑
CoV
‑
2颗粒在300至700ppm、更优选500ppm的浓度下被β
‑
丙内酯灭活，并在2℃至8℃下被灭活约1至48小时、优选20至28小时、最优选24小时
±
2小时(例如也
±
1小时或
±
0.5小时)，然后可选地在35℃至39℃、优选约37℃下水解2.5小时
±
0.5小时。5.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，还包含紫外线(UV)灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒。6.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中与所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒中的病毒RNA相比，所述灭活的SAR
‑
CoV
‑
2颗粒中的表面蛋白包含减少的修饰，优选地其中与所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒中的病毒RNA相比，所述表面蛋白包含的修饰残基比例降低；所述修饰涉及天然SARS
‑
CoV
‑
2颗粒，优选地其中所述修饰包含烷基化和/或酰化的核苷酸或氨基酸残基。7.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒包含下列的天然构象：(i)尖峰(S)蛋白；(ii)核衣壳(N)蛋白；(iii)膜(M)糖蛋白；和/或(iv)包膜(E)蛋白；优选地其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒包含天然构象尖峰(S)蛋白。8.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒包含一种或多种β
‑
丙内酯修饰的半胱氨酸、蛋氨酸和/或组氨酸残基。9.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒包含少于200、100、50、30、20、15、10、9、8、7或6个β
‑
丙内酯修饰的氨基酸残基；优选地其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的尖峰(S)蛋白包含少于100、50、30、20、15、10、9、8、7或6个β
‑
丙内酯修饰的氨基酸残基；更优选地其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒或其尖峰蛋白包含15个或更少的β
‑
丙内酯修饰的氨基酸残基；最优选地其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒或其尖峰蛋白包含1至100、2至50、3至30、5至20或约15个β
‑
丙内酯修饰的氨基酸残基。10.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述颗粒中少于20％、15％、10％、5％或4％的SARS
‑
CoV
‑
2多肽是β
‑
丙内酯修饰的；优选地其中所述颗粒中0.1
‑
10％、更优选1
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5％、更优选2
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8％或约3
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6％的SARS
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CoV
‑
2多肽包含至少一种β
‑
丙内酯修饰；优选如通过质谱在所述疫苗中检测的，任选在用胰蛋白酶、糜蛋白酶和/或PNGase F酶消化或酸水解之后。11.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中:(i)所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的尖峰(S)蛋白包含以下一个或多个残基的β
‑
丙内酯修饰：49、146、166、177、207、245、379、432、519、625、1029、1032、1058、1083、1088、1101、1159和/或1271；优选H49、H146、C166、M177、H207、H245、C432、H519、H625、M1029、H1058、
H1083、H1088、H1101、H1159和/或H1271；或H207、H245、C379、M1029和/或C1032，例如在SEQ ID NO:3中，或SEQ ID NO:19、21、23、25或27中的相应位置；和/或(ii)所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的膜(M)糖蛋白包含以下一个或多个残基的β
‑
丙内酯修饰：125、154、155、159和/或210；优选H154、H155、C159和/或H210，例如在SEQ ID NO:29中；(iii)所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒的核衣壳(N)蛋白包含M234处的β
‑
丙内酯修饰，例如在SEQ ID NO:28中。12.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒中少于30％、20％、10％、5％、3％或1％的以下一个或多个残基，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或以下所有残基是β
‑
丙内酯修饰的：(i)在尖峰(S)蛋白中，残基49、146、166、177、207、245、379、432、519、625、1029、1032、1058、1083、1088、1101、1159和/或1271；优选H49、H146、C166、M177、H207、H245、C432、H519、H625、M1029、H1058、H1083、H1088、H1101、H1159和/或H1271；或H207、H245、C379、M1029和/或C1032；例如在SEQ ID NO:3中，或在SEQ ID NO:19、21、23、25或27中的对应位置；和/或(ii)膜(M)糖蛋白中的残基125、154、155、159和/或210；优选H154、H155、C159和/或H210；例如在SEQ ID NO:29中；和/或(iii)核衣壳(N)蛋白的M234，例如在SEQ ID NO:28中。13.根据任何前述权利要求所述的SARS
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CoV
‑
2疫苗，其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒中以下每个位置的β
‑
丙内酯修饰残基的比例为：(i)在尖峰(S)蛋白(例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:19、21、23、25或27中的对应位置)中：(a)残基H49、H146、C166、H207、H519、M1029、H1083、H1088、H1101、H1159和/或H1271：小于20％，优选0.01至10％，更优选0.1至5％；和/或(b)残基M177、C432、H625：小于30％，优选0.1至20％，更优选1至10％；和/或(c)残基H245、H1058：小于30％，优选0.1至20％，更优选5至15％；(ii)在膜(M)糖蛋白中(例如SEQ ID NO:29)：(f)H154：小于5％，小于1％或小于0.1％；和/或(g)H155：小于10％，优选0.1至5％；和/或(h)C159：小于5％，小于1％或小于0.1％；和/或(i)H210：小于20％，优选0.1至10％；和/或(iii)在核衣壳(N)蛋白(例如SEQ ID NO:28)中：(j)M234：小于90％、小于10％或小于0.1％。14.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中与天然SARS
‑
CoV
‑
2颗粒相比，所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒对哺乳动物细胞的传染性降低至少99％、99.99％或99.9999％，或其中所述灭活的SARS
‑
CoV
‑
2颗粒对哺乳动物细胞的传染性是不可检测的。15.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂，例如人血清白蛋白(HSA)。16.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，还包含佐剂。17.根据权利要求16所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述佐剂包括氢氧化铝或磷酸铝。18.根据权利要求17所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中氢氧化铝或磷酸铝是所述疫苗中唯
一的佐剂。19.根据权利要求16或17所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述佐剂包括或进一步包括Th1响应导向佐剂。20.根据权利要求19所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述Th1响应导向佐剂包括3
‑
O
‑
脱酰基
‑4′‑
单磷酰脂质A(MPL)、皂甙QS
‑
21、含CpG的寡核苷酸(CpG ODN)、角鲨烯、DL
‑
α
‑
生育酚、阳离子肽、含脱氧核苷酸的免疫刺激寡核苷酸分子(I
‑
ODN)和/或咪喹莫特。21.根据权利要求16所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述佐剂包括：(i)脂质体制剂，包含3
‑
O
‑
脱酰基
‑4′‑
单磷酰脂质A(MPL)和皂甙QS
‑
21，优选佐剂系统01；(ii)CpG ODN，包含序列5
’
TGACTGTGAACGTTCGAGATGA 3
’
(SEQ ID NO:4)，优选CpG 1018；(iii)角鲨烯、DL
‑
α
‑
生育酚和聚山梨酯80(优选佐剂系统03)；(iv)水包油乳液，包含角鲨烯、吐温80和Span 85，优选MF59；(v)序列KLKL5KLK(SEQ ID NO:5)和寡
‑
d(IC)
13
(SEQ ID NO:6)、优选IC31的肽；或(vi)铝盐和任选的Th1导向佐剂。22.根据任何前述权利要求所述的SARS
‑
CoV
‑
2疫苗，其中所述疫苗能够以至少70％的概率将施用SARS
‑
CoV
‑
2疫苗的受试者...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：瓦尔内瓦奥地利有限责任公司，
类型：发明
国别省市：