CpG-佐剂的SARS-CoV-2病毒疫苗制造技术

本文描述了CpG佐剂的SARS

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】Immunopathology on Challenge with the SARS Virus.PlosOne 7(4):e35421)。在将其他佐剂(例如CpG)包括在疫苗或已知可驱动针对Th1的免疫应答的其他疫苗制剂中后，未观察到这一点。就已设想的灭活疫苗方法而言，在标准条件下使用典型的灭活剂(例如甲醛)可具有缺点，这阻碍了有效候选疫苗的开发。本专利技术旨在解决这些问题，并因此生产克服现有技术缺点的安全有效的全病毒灭活SARS
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CoV
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2疫苗。
[0004]因此，在一个方面，本专利技术提供了一种SARS
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CoV
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2疫苗，包含灭活的SARS
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CoV
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2颗粒与胞嘧啶磷酸鸟苷(CpG)和明矾佐剂组合。如上所述，为SARS
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CoV
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2疫苗选择合适的一种或多种佐剂可至关重要。尽管明矾的使用可不一定会导致人类Th2歪斜(skewing)，但添加CpG被认为可以缓解可与疫苗相关的疾病增强安全问题。添加CpG可进一步显著降低受试者实现血清转化所需的抗原剂量(即“剂量节省”)，这是考虑到全球对SARS
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CoV
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2疫苗的迫切需求的另一个重要考虑因素。最后，添加佐剂有助于在特别易受SARS
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CoV
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2发病率或死亡率影响或易受其影响的受试者(即免疫功能低下、怀孕或老年受试者)中产生强烈的免疫反应。下面更详细地描述这种疫苗组合物。r/>[0005]在优选方面，疫苗中灭活的SARS
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CoV
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2颗粒的表面呈现天然构象，使得疫苗能够在人受试者中产生针对天然SARS
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CoV
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2颗粒的中和抗体。特别是，本专利技术旨在提供最佳灭活的SARS
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CoV
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2颗粒，其不能复制和感染人类细胞，但保留病毒表面蛋白的免疫原性表位，因此适合于在接种受试者中产生保护性免疫。通过优化灭活过程(例如使用β
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丙内酯)和疫苗生产中的其他步骤，包括选择合适的佐剂，可以获得新的疫苗组合物，其保留SARS
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CoV
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2颗粒的天然表面构象，并降低疫苗诱导的免疫病理学或疾病增强的风险。因此，在一个方面，所述SARS
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CoV
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2疫苗组合物包含β
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丙内酯灭活的SARS
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CoV
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2颗粒，其中所述疫苗能够在人受试者中产生针对天然SARS
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CoV
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2颗粒的中和抗体，优选地其中所述SARS
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CoV
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2颗粒的天然表面构象保存在所述疫苗中。
[0006]在另一特定方面，本专利技术旨在提供最佳灭活(例如β
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丙内酯灭活)SARS
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CoV
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2颗粒的最佳组合，其不能复制和感染人类细胞，但保留病毒表面蛋白的免疫原性表位，因此适合于在接种受试者中产生保护性免疫。通过灭活的SARS
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CoV
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2颗粒与明矾和CpG佐剂的最佳组合，可以获得一种改进的疫苗组合物，其能够在人受试者中产生针对天然SARS
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CoV
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2颗粒和/或其他免疫应答的中和抗体，所述抗体能够部分或完全保护超过50％、优选超过60％、超过70％、超过80％、超过90％的所述已接种的受试者。
[0007]本专利技术的每个限制可以包括本专利技术的各种实施例。因此，预期涉及任何一个元件或元件组合的本专利技术的每个限制可以包括在本专利技术的各个方面中。本专利技术的应用不限于以下描述或附图中所示的构件的构造和布置细节。本专利技术能够以各种方式实施或实施其它实施例。
附图说明
[0008]附图并非按比例绘制。附图仅是说明性的，并且不需要用于实现本公开。为清晰起见，并非每个部件都可以在每个图纸中标记。在附图中：
[0009]图1.本专利技术灭活的SARS
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CoV
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2疫苗的制备方法。步骤包括Vero宿主细胞的细胞聚集、用SARS
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CoV
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2感染Vero细胞、病毒收获、DNA减少、一次灭活、纯化、任选的二次灭活和用佐剂配制。该病毒可配制有或无氢氧化铝。CpG佐剂可与病毒(和任选的明矾)包含在同一小
瓶中，或在施用前与病毒混合。
[0010]图2.在SARS
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CoV
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2大流行期间，报告了来自世界各地分离株的SARS
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CoV
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2基因组序列，包括最近的新变体或谱系，如英国B1.1.7、巴西P1、加利福尼亚B.1.427/B.1.429和南非B.1.351谱系。完整SARS
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CoV
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2基因组序列的登录号和来源以表格形式提供，以及相应orf1ab多蛋白和S蛋白的登录号(如果可用)(
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或无登录＝不可用)。
[0011]图3.蔗糖梯度离心的优选设置用作本专利技术SARS
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CoV
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2疫苗的抛光步骤。
[0012]图4.对SARS
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CoV
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2疫苗反应的总IgG。包衣抗原：S1(A)，尖峰蛋白(B)和核蛋白(C)的受体结合域。终点效价：用作截止值的空白的3倍吸光度(虚线)。
[0013]图5.响应单独用明矾和明矾/CpG 1018佐剂的SARS
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CoV
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2疫苗的IgG1和IgG2a滴度。通过ELISA测定S1蛋白的特异性抗体滴度。通过与mAb亚类标准曲线比较确定浓度。
[0014]图6.响应SARS
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CoV
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2疫苗的中和滴度。在35天采集受试小鼠血清。在明矾/CpG 1018存在下，观察到的中和反应在SARS
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CoV
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2阳性的恢复期供体血浆范围内(NIBSC 20/162；来自三个供体的合并血清)。
[0015]图7.制备过程递送高密度和完整的尖峰蛋白。所示为根据实施例1制备的SARS
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CoV
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2灭活药物的电子显微照片。每AU约1
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1.5 107个病毒颗粒。
[0016]图8.SARS
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CoV
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2和JEV药物的尺寸排阻色谱和SDS
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PAGE图谱比较。根据SDS
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PAGE(银染，减少)的高纯度(>95％)，以及根据SE
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HPLC的单体病毒(>95％)。由于不同的病毒粒径(JEV本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】1.SARS
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CoV
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2疫苗，包含：i)灭活的SARS
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CoV
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2颗粒；ii)含有CpG的寡核苷酸(CpG ODN)；以及iii)明矾佐剂。2.根据权利要求1所述的SARS
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CoV
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2疫苗，其中所述CpG ODN是由SEQ ID NO:4定义的CpG 1018，并且所述明矾佐剂是氢氧化铝。3.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述疫苗组合物中的明矾(Al
3+
)：CpG(w/w)比为约1:10、约1:5、约1:4、约1:3、约1:2、约1:1、约2:1、约3:1、约4:1、约5:1、约10:1，优选约1:3和3:1之间，更优选约1:2和1:1之间。4.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述疫苗组合物中的明矾∶CpG(w/w)比为约1:2。5.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述疫苗的明矾含量为约0.1至2mg/mL、约0.2至1.5mg/mL、约0.5至1.3mg/mL，特别是约0.8至1.2mg/mL，最优选约1mg/mL，即0.5mg/剂量，其中所述疫苗以0.5ml的体积递送。6.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述疫苗的CpG含量为约0.25至6mg/mL、约0.5至3mg/mL、约1至3mg/mL，特别是约1.5至2.5mg/mL，最优选约2mg/mL、即1mg/剂量，其中所述疫苗以0.5ml的体积递送。7.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中如SEC
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HPLC评估，所述疫苗中每剂量灭活的SARS
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CoV
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2病毒的量为约0.01至25mAU(毫吸收单位x分钟)，优选约0.05至10mAU，更优选约0.1至5mAU之间，最优选约0.25至2.5mAU，其中所述疫苗以0.5mL的体积递送。8.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中基于所述疫苗组合物中的CpG总量，所述疫苗组合物中游离(未结合)CpG的量大于10％、大于20％、大于30％、大于40％、大于50％、大于60％、大于70％、大于80％、大于90％、大于95％，优选约70％至95％，最优选约80％至90％(w/w)。9.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述疫苗组合物包含至少一种缓冲剂，优选磷酸盐缓冲剂。10.根据权利要求2至9中任一项所述的SARS
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CoV
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2疫苗，其中包含氢氧化铝的所述疫苗含有少于1.25ppb的铜。11.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒中的病毒RNA是复制缺陷的。12.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒中的病毒RNA：(i)被烷基化和/或酰化；(ii)包含一种或多种修饰的嘌呤(优选鸟嘌呤)残基或链断裂；和/或(iii)与一种或多种病毒蛋白质交联。13.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述病毒颗粒是β
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丙内酯灭活的SARS
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CoV
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2颗粒，优选在300至700ppm、更优选500ppm的浓度下被灭活约1至48小时、优选20至28小时、最优选24小时。14.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述病毒颗粒是紫外线(UV)灭活的SARS
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CoV
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2颗粒。15.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中与所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒中的病毒RNA相比，所述灭活的SAR
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CoV
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2颗粒中的表面蛋白包含减少的修饰，优选地
其中与所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒中的病毒RNA相比，所述表面蛋白包含的修饰残基比例降低；所述修饰涉及天然SARS
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CoV
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2颗粒，优选地其中所述修饰包含烷基化和/或酰化的核苷酸或氨基酸残基。16.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒包含下列的天然构象：(i)尖峰(S)蛋白；(ii)核衣壳(N)蛋白；(iii)膜(M)糖蛋白；和/或(iv)包膜(E)蛋白；优选地其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒包含天然构象尖峰(S)蛋白。17.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒包含一种或多种β
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丙内酯修饰的半胱氨酸、蛋氨酸和/或组氨酸残基。18.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒包含少于200、100、50、30、20、15、10、9、8、7或6个β
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丙内酯修饰的氨基酸残基；优选地其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒的尖峰(S)蛋白包含少于100、50、30、20、15、10、9、8、7或6个β
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丙内酯修饰的氨基酸残基；更优选地其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒或其尖峰蛋白包含20个或更少的β
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丙内酯修饰的氨基酸残基；最优选地其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒或其尖峰蛋白包含1至100、2至50、3至30、10至20或约15个β
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丙内酯修饰的氨基酸残基。19.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述颗粒中少于20％、15％、10％、5％或4％的SARS
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CoV
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2多肽是β
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丙内酯修饰的；优选地其中所述颗粒中0.1
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10％、更优选1
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5％、更优选2
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8％或约3
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6％的SARS
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CoV
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2多肽包含至少一种β
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丙内酯修饰；优选如通过质谱在所述疫苗中检测的，任选在用胰蛋白酶、糜蛋白酶和/或PNGase F酶消化或酸水解之后。20.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中:(i)所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒的尖峰(S)蛋白包含以下一个或多个残基的β
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丙内酯修饰：49、146、166、177、207、245、379、432、519、625、1029、1032、1058、1083、1088、1101、1159和/或1271；优选H49、H146、C166、M177、H207、H245、C432、H519、H625、M1029、H1058、H1083、H1088、H1101、H1159和/或H1271；或H207、H245、C379、M1029和/或C1032，例如在SEQ ID NO:3中，或SEQ ID NO:19、21、23、25或27中的相应位置；和/或(ii)所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒的膜(M)糖蛋白包含以下一个或多个残基的β
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丙内酯修饰：125、154、155、159和/或210；优选H154、H155、C159和/或H210，例如在SEQ ID NO:29中；(iii)所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒的核衣壳(N)蛋白包含M234处的β
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丙内酯修饰，例如在SEQ ID NO:28中。21.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒中少于30％、20％、10％、5％、3％或1％的以下一个或多个残基，优选至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或以下所有残基是β
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丙内酯修饰的：(i)在尖峰(S)蛋白中，残基49、146、166、177、207、245、379、432、519、625、1029、1032、1058、1083、1088、1101、1159和/或1271；优选H49、H146、C166、M177、H207、H245、C432、H519、H625、M1029、H1058、H1083、H1088、H1101、H1159和/或H1271；或H207、H245、C379、M1029和/或C1032；例如在SEQ ID NO:3中，或在SEQ ID NO:19、21、23、25或27中的对应位置；和/或(ii)膜(M)糖蛋白中的残基125、154、155、159和/或210；优选H154、H155、C159和/或H210；例如在SEQ ID NO:29中；和/或(iii)核衣壳(N)蛋白的M234，例如在SEQ ID NO:28中。
22.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒中以下每个位置的β
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丙内酯修饰残基的比例为：(i)在尖峰(S)蛋白(例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:19、21、23、25或27中的对应位置)中：(a)残基H49、H146、C166、H207、H519、M1029、H1083、H1088、H1101、H1159和/或H1271：小于20％，优选0.01至10％，更优选0.1至5％；和/或(b)残基M177、C432、H625：小于30％，优选0.1至20％，更优选1至10％；和/或(c)残基H245、H1058：小于30％，优选0.1至20％，更优选5至15％；(ii)在膜(M)糖蛋白中(例如SEQ ID NO:29)：(f)H154：小于5％，小于1％或小于0.1％；和/或(g)H155：小于10％，优选0.1至5％；和/或(h)C159：小于5％，小于1％或小于0.1％；和/或(i)H210：小于20％，优选0.1至10％；和/或(iii)在核衣壳(N)蛋白(例如SEQ ID NO:28)中：(j)M234：小于90％、小于10％或小于0.1％。23.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中与天然SARS
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CoV
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2颗粒相比，所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒对哺乳动物细胞的传染性降低至少99％、99.99％或99.9999％，或其中所述灭活的SARS
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CoV
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2颗粒对哺乳动物细胞的传染性是不可检测的。24.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，还包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。25.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述SARS
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CoV
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2颗粒包含对应于下列DNA序列的RNA序列(和/或其片段，任选包含修饰的(优选烷基化或酰化的)核苷酸残基)：(i)由SEQ ID NO:9定义；或(ii)与SEQ ID NO:9具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少99％的序列同一性；优选地其中包含RNA序列的天然(非灭活)SARS
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CoV
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2颗粒能够包封强毒力的SARS
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CoV
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2。26.根据前述权利要求中任一项所述的SARS
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Cov
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2疫苗，其中所述疫苗包含额外的SARS
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CoV
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2颗粒，该颗粒包含对应于下列DNA序...

【专利技术属性】
技术研发人员：A，
申请(专利权)人：戴纳瓦克斯技术公司，
类型：发明
国别省市：