添加铁改善细胞培养制造技术

本发明专利技术提供了在细胞培养物中增加细胞密度、存活性和/或效价的方法等，包括将含铁组合物添加至细胞培养物中的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术提供了在细胞培养物中增加细胞密度、存活性和/或效价的方法等，包括将含铁组合物添加至细胞培养物中的步骤。【专利说明】添加铁改善细胞培养相关申请本申请要求2011年10月21日申请的美国临时申请61/550，058的权益，其全文并入本文参考。背景哺乳动物细胞培养中的常见问题是培养结束时细胞死亡，其可由多种攻击导致，例如营养物耗竭、抑制物建立和/或氧化应激等等。通常并且特别对于利用哺乳动物培养系统的人们而言感兴趣的是表达药物学相关蛋白质产物、在细胞培养过程中保持细胞存活性和/或延迟细胞死亡。已采用了一些方法以增加细胞培养物的存活性，例如应用培养基添加剂和过表达抗凋亡基因。见例如Arden, et al.“Chemical caspase inhibitorsenhance cell culture viabilities and protein titer，，Biotechnol Prog.2007Mar_Apr;23(2):506-511;Mastrangelo, et al.“Antiapoptosis chemicals prolong productivelifetimes of mammalian cells upon Sindbis virus vector infection，，BiotechnolBioeng.1999Nov5;65 (3):298-305;Balcarcel, et al.uRapamycin Reduces HybridomaCell Death and Enhances Monoclonal Antibody Production，，Biotechnology and Bioengineering, 2001Vol.76，1-10;Zanghi et al.“The growth factor inhibitorsuramin reduces apoptosis and cell aggregation in protein-free CHO cell batchcultures.Biotechno 1.Prog.2000, 16, 319-325; Simpson, et al.“Prevention ofhybridoma cell death by bcl_2during suboptimal culture conditions，，BiotechnolBioengl997, 54:1-16;Singh,et al.“Enhancement of survivability of mammaliancells by overexpression of the apoptosis suppressor gene bcl_2.，，BiotechnolBioeng.1996, 52:166-175;Mastrangelo,et al.“Overexpression of bcl-2famiIymembers enhances survival of mammalian cells in response to variousculture insults.，，Biotechnology and Bioengineering, 2000，Vol67, 555-564 ; Arden,et al.“Inhibiting the apoptosis` pathway using MDM2in mammalian cellcultures.，，Biotechnology and Bioengineering, 2007; Vol.97，601-614)。然而，在一些情况中，应用培养基添加剂可以延迟细胞周期进程，导致较低细胞密度，因此较低产率。一些培养基添加剂可保护细胞免于在生长期凋亡，但是在死亡期无效。另外，大多数培养基添加剂很昂贵，其对于大规模药物生产可能不实用。对于抗凋亡基因的过表达，基因转染是挑战，并且效果可能是依赖于不同个案的。因此，需要改善细胞培养增加细胞存活性、密度和/或效价。概述本专利技术涵盖了出人意料的发现，即添加铁、特别是高浓度的铁到细胞培养基中可以显著改善培养物的细胞密度、存活性和/或效价，还有其他益处。因此，本专利技术提供了改善细胞培养的有效但不昂贵以及容易的解决办法。本专利技术在改善延长的细胞培养结束时的存活性中特别有用。在一个方面，本专利技术提供了增加细胞培养物中的细胞密度、存活性和/或效价的方法，包括步骤:提供在细胞培养基中的细胞以起始细胞培养过程(例如生产细胞培养过程)，及在细胞培养过程中添加含铁组合物至所述细胞培养基，由此细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程期间增加。根据本专利技术，所述含铁组合物可以选自多种含铁化合物。在一些实施方案中，所述含铁组合物选自FeS04、Fe-柠檬酸盐(Fe-citrate)、Fe-运铁蛋白、Fe-氯化物(Fe-Chloride)、Fe-硝酸盐(Fe-nitrate)、Fe-EDTA、Fe (NO3) 3、FeCl2、FeCl3 及其组合。在一些实施方案中，本专利技术方法包括在整个细胞培养过程的时间点添加含铁组合物。在一些实施方案中，含铁组合物在第O天后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第I天或第I天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第3天或第3天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第6天或第6天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在第9天或第9天之后添加。在一些实施方案中，含铁组合物在细胞培养过程期间多个时间点添加。在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度(例如在一或多次加入含铁组合物之后)范围在100 μ M和5mM之间。在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度范围在300 μ M和ImM之间。在一些实施方案中，细胞培养基中的铁浓度是ImM。本专利技术可以使用多种细胞类型。例如，在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞选自BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系、人成视网膜细胞(PER.C6)、猴肾细胞、人胚肾细胞系(293)、幼仓鼠肾细胞(BHK)、中华仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠睾丸支持细胞、非洲绿猴肾细胞(VER0-76)、人宫颈癌细胞(HeLa)、犬肾细胞、buffalo大鼠肝细胞、人肺细胞、人肝细胞、小鼠乳腺肿瘤细胞、TRI细胞、MRC5细胞、FS4细胞或者人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。在一些实施方案中，所述哺乳动物细胞是CHO细胞。在一些实施方案中，所述细胞培养过程是补料分批培养过程。在一些实施方案中，所述细胞培养过程是分批-再流加培养过程(batch-refeedculture process)。在一些实施方案中，所述细胞培养过程 是灌注培养过程。在一些实施方案中，所述细胞培养过程是大规模生产培养过程。在一些实施方案中，细胞培养基体积是至少大约500L。在一些实施方案中，细胞培养在摇瓶中进行。在一些实施方案中，加入补充蛋白质以改善细胞培养密度、存活性和/或效价。在一些实施方案中，细胞培养基不含水解物。在一些实施方案中，细胞培养基含有水解物。在一些实施方案中，细胞携带编码重组蛋白的基因。在一些实施方案中，所述重组蛋白是抗体或其片段。在一些实施方案中，所述抗体是本文档来自技高网...

【技术保护点】
增加细胞培养基中的细胞密度、存活性和/或效价的方法，包括步骤：(a)提供在细胞培养基中的细胞以起始细胞培养过程；及(b)在细胞培养过程期间将含铁组合物添加至所述细胞培养基，从而在所述细胞培养基中的铁浓度在细胞培养过程期间增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：W·王，YT·栾，D·德拉波，R·P·诺兰，
申请(专利权)人：辉瑞公司，
类型：发明
国别省市：美国;US