多级PCR检测病原体的方法和试剂盒技术

本发明专利技术公开了多级PCR检测病原体的方法和试剂盒。本发明专利技术方法通过在全封闭体系中，用两对或多对所述病原体特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的病原体的核酸物质，并通过测序等方法准确地确定病原体的种类或型别。本发明专利技术方法实现了在全封闭体系内、可简便地在多级PCR过程中对各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，从而根本上消除了PCR的交叉干扰，使作为临床检测的极度灵敏的、但却又无法广泛实际应用的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。

【技术实现步骤摘要】
【专利摘要】本专利技术公开了多级PCR检测病原体的方法和试剂盒。本专利技术方法通过在全封闭体系中，用两对或多对所述病原体特异性引物，通过多级PCR扩增待测样品中的病原体的核酸物质，并通过测序等方法准确地确定病原体的种类或型别。本专利技术方法实现了在全封闭体系内、可简便地在多级PCR过程中对各级之间实现PCR扩增产物的按需转移，从而根本上消除了PCR的交叉干扰，使作为临床检测的极度灵敏的、但却又无法广泛实际应用的多级PCR反应，能够在普通医院环境中进行。【专利说明】多级PCR检测病原体的方法和试剂盒
本专利技术涉及生物和检测领域，具体地，本专利技术涉及多级PCR检测病原体的方法和试剂盒及其应用。
技术介绍
病原体导致人类或其他动物患病的主要原因。以HPV为例，人乳头瘤病毒是乳头瘤病毒科(Papillomaviridae)的成员，是具有8000bp环状基因组的DNA肿瘤病毒。已知，人乳头瘤病毒(HPV)与某些肿瘤的发病率显示强烈的相关。HPV在99%宫颈癌病人中可检测到。以流行病学资料为基础，在感染的病人中，不同HPV基因型在形成宫颈癌中不会造成相同的风险水平。根据这些发现基因型可分为低风险、中等风险和闻风险等级，除了这些，也存在未分类的基因型。因为风险在很大的范围内变化，并且HPV感染的发病率很高，所以确定基因型极为重要。该病原体(如病毒)的目前主要检测方法有:特异性PCR(Type-specific PCR)法:该法根据E6、E7基因的变异区设计型特异性的引物进行PCR分析(Walboomers，1999)，其灵敏度大约在几十至数百个HPV拷贝每反应，随HPV型别不同而稍有差异。然而，因为每份样本都需要同时作多份PCR，则导致无法高通量的使用。PCR是涉及通过多个循环，指数扩增某种多核苷酸序列的技术。PCR技术是众所周知的，并且已经被广泛使用。PCR技术一般包括以下步骤`:变性多核苷酸，然后将至少一对引物寡核苷酸退火到变性的多核苷酸上(使引物与变性的多核苷酸模板杂交)。退火步骤之后，具有聚合酶活性的酶，使用最初的变性多核苷酸作为合成模板，催化合成一条新的掺入了引物寡核苷酸的多核苷酸链。这一系列步骤(变性、引物退火和引物延伸)构成一个PCR循环。随着循环的重复，新合成的多核苷酸的量指数增加，因为由较早循环新合成的多核苷酸可用作后续循环的合成模板。DNA的变性一般发生在约90-95°C，引物一般在约40_60°C退火至变性的DNA，用聚合酶延伸退火的引物的步骤一般在约70-75°C进行。因此，在PCR循环中，必须改变反应混合物(反应体系)的温度，在多循环PCR实验中要多次改变。PCR技术具有广泛的生物学应用，包括例如，DNA序列分析、探针产生、克隆核酸序列、定位诱变、检测基因突变、诊断病毒感染、分子“指纹分析”和监测生物液体和其他来源中的污染微生物。然而,在实际应用中，无论的常规PCR反应还是多重PCR反应体系,如果环境或操作过程中引入极少量外源性DNA污染，就可能出现假阳性结果。为了防止污染，一些实验不得不在高度洁净的操作设备或操作室进行。在PCR反应过程中，各种试验条件控制不当很容易导致扩增失败，降低其灵敏度和特异性。此外，现有PCR技术能够检测的灵敏度还难以令人满意，尤其是在对含量极低的核酸样品(如仅含1-10个拷贝目标序列的样品)。在活检、尸检样品中检测病原体(如HPV)时，因无关核酸物质的存在，检测灵敏度一直难以提高。沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)是有独特发育周期的原核细胞型微生物，其原体具有感染性，侵入细胞后发育形成始体也称为网状体，不具感染性，在细胞内生长和复制约24~40小时后，转化为原体，并释放到细胞外，再感染新的宿主细胞。沙眼衣原体是引起非淋菌性尿道炎的主要病原体，可由宫颈上行到子宫和输卵管可引起无症状的上生殖道感染，导致异位妊娠、原发性不育。临床表现为妇女的子宫颈管炎，子宫内膜炎，急性输卵管炎和盆腔炎。孕妇患有沙眼衣原体感染时，还可能引起胎儿流产，早产和新生儿感染沙眼衣原体性结膜炎，沙眼衣原体性肺炎。在国外的一些研究中，从11%的无症状士兵，11%城市急诊部门无症状男性和7%无症状的大学生中分离到沙眼衣原体。近年来，沙眼衣原体感染患者有明显的上升趋势，耐药率显著增加。目前，沙眼衣原体主要依靠宫颈分泌物实验室检查。常用的检测方法有两种。一是细胞培养，该方法特异性高达100%，但沙眼衣原体细胞无法人工培养，只能用传代细胞或原代细胞培养，造成检测的困难。二是抗原检测法，包括直接荧光抗体法及酶免疫分析。此外，还有一些基于核酸的检测方法，和不基于核酸的检测方法如Gen-Probe Pace2C system等。然而，现有的检测方法对低宫颈癌发病人群需做大量的阴道镜，且阳性预测值较低，常常导致漏检。而且，某些核酸检测试剂盒对一些变异株会失效。如对沙眼衣原体377bp删除的变异株就无法使用现有手段进行检测。再次，沙眼衣原体检测的重复性差，核酸检测(NAA)对疾病盛行率较低的人群进行检测时，得到难以接受的低阳性预测值，必须通过多次试验减少误差。最后，核酸测试方法很容易造成交叉反应(Cross-reaction),造成结果的不准确。综上所述，本领域目前尚缺乏一种准确，快速，高效的沙眼衣原体检测方法。
技术实现思路
本专利技术的目的就是提供一种灵敏度高、特异性好、抗干扰能力强的PCR反应设备和方法。本专利技术的第一方面，提供了一种鉴别病原体种类或型别的方法，包括步骤:(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物Pi ；(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2 ；(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+Ι级PCR隔室中，作为第i+Ι级PCR的模板，并在封闭的第i+Ι级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第i + I引物对进行扩增，从而获得第i+Ι扩增产物Pi + 1，其中i为> 2的正整数；本步骤可进行一次或多次；(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i + I扩增产物Pi+1，进行测序，从而获得扩增产物的序列；和(e)将测得的扩增产物序列与病原体标准序列进行比对，从而鉴别出病原体的种类或型别。较佳地，所述病原体选自下组:病毒、立克次体、细菌、寄生虫、衣原体。在另一优选例中，在步骤(b)和(C)中，将第j扩增产物Pj从第j级PCR隔室转移至第j + I级PCR隔室过程中，第j级PCR隔室和第j + I级PCR隔室都处于封闭状态，其中j为> I的正整数，并且在第j级PCR隔室和第j + I级PCR隔室之间设有封闭的或可封闭的连接通道，所述连接通道用于让携带PCR扩增产物的固体颗粒从Pj级隔室(或上游隔室)转移至Pj+1级隔室(或下游隔室)。在另一优选例中，在步骤(a)、(b)和(C)的整个过程中，所有的PCR隔室都处于封闭状态。在另一优选例中，在步骤(a)中，第一级PCR隔室中放置有可携带PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别病原体种类或型别的方法，其特征在于，包括步骤：(a)在封闭的第一级PCR反应腔或隔室中，以含有或可能含有病原体核酸的样本为模板，通过所述病原体特异性的第一引物对进行扩增，从而获得第一扩增产物P1；(b)将第一扩增产物从第一级PCR隔室转移至第二级PCR隔室中，作为第二级PCR的模板，并在封闭的第二级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第二引物对进行扩增，从而获得第二扩增产物P2；(c)任选地，将上一步骤的扩增产物Pi从第i级PCR隔室转移至第i+1级PCR隔室中，作为第i+1级PCR的模板，并在封闭的第i+1级PCR隔室中，通过所述病原体特异性的第i＋1引物对进行扩增，从而获得第i+1扩增产物Pi＋1，其中i为≥2的正整数；本步骤可进行一次或多次；(d)对上一步骤中获得的所述第二扩增产物P2或所述第i＋1扩增产物Pi+1，进行测序，从而获得扩增产物的序列；和(e)将测得的扩增产物序列与病原体标准序列进行比对，从而鉴别出病原体的种类或型别。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：洪国藩，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31