针对内体/溶酶体酶的抑制剂制造技术

本发明专利技术涉及一种多功能蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂可以与多种分子缀合。本发明专利技术还涉及所述蛋白酶抑制剂及其缀合物的应用。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】针对内体/溶酶体酶的抑制剂专利
本专利技术涉及一种多功能蛋白酶抑制剂，所述蛋白酶抑制剂可以与多种分子缀合。本专利技术还涉及所述蛋白酶抑制剂及其缀合物的应用。专利技术背景蛋白酶抑制剂已经作为一种强力的药物种类出现1。其包括血管紧张素转化酶的抑制剂、HIV蛋白酶的抑制剂和蛋白酶体抑制剂，诸如用来治疗多发性骨髓瘤（multiplemyeloma）的硼替佐米（Bortezomib）(Velcade(万珂))2。由于其在宽泛种类的生物学系统的调节中起重要作用，内体-溶酶体途径的蛋白酶常常被提议为治疗靶标3。例如，溶酶体半胱氨酸和天冬氨酰蛋白酶在一些锥虫物种中是验证的药物靶标4，并且某些内体蛋白酶的上调与增加的恶性肿瘤（malignancy）相关5。天冬酰胺酰内肽酶（AEP或legumain）也已经参与了恶性黑素瘤（melanoma）的进展6，参与对治疗性药物l-天冬酰胺酶的破坏和参与神经兴奋毒性（neuroexitotoxity）7。作为天然的半胱氨酸蛋白酶抑制剂的半胱氨酸蛋白酶抑制剂(cystatin)的下调可以导致增加的恶性肿瘤8和不完善的免疫应答9。非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkin’slymphoma）中的组织蛋白酶D(CatD)的高表达也已经与增加的恶性肿瘤相关10，并且还与乳腺癌的不良预后相关11。由于最近的一些研究表明抗原呈递细胞的内体中的蛋白水解活性可能太高，导致抗原破坏和对T细胞的不充分的呈递，所以，内体蛋白酶抑制剂的另一种潜在的治疗应用可能是免疫调节。因此，蛋白酶抗性抗原通常引起更稳健的免疫应答12,13。综合上述，似乎内体/溶酶体蛋白酶活性的有效下调物可能是对治疗“武器”的有价值的补充。然而，由于存在多个具有广泛的功能冗余性的内体蛋白酶家族14，因此，迄今为止，内体/溶酶体蛋白酶功能的调控仍然是具有挑战性的。还有另外一个问题，在参考文献中存在证据表明特定蛋白酶的敲低/抑制导致其他蛋白酶的上调3,15。大部分内体蛋白酶属于3个独特的家族：存在一些木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶(PLCPs)，其包括组织蛋白酶L,S,B,C和几种其他的蛋白酶16。除了这些以外存在与胃蛋白酶相关的天冬氨酰蛋白酶；组织蛋白酶D和E。最后，存在称作天冬酰胺酰内肽酶（AEP）或legumain的另一种半胱氨酸蛋白酶，其与半胱天冬酶(caspase)更加紧密相关17。这三种种类中的每一种都可以被不同的且不重叠的小分子抑制剂抑制18，但是，这些蛋白酶的体内抑制或敲除通常表现出有限的表型或没有表型，这最可能是由于功能冗余性引起。因此，我们认为以内体特异性方式抑制所有三个内体蛋白酶家族将提供调节内体/溶酶体功能的有效工具。PLCPs和AEP被天然存在的14kDa蛋白，即，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C有效抑制。所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是一个小蛋白家族，其以纳摩尔之下（sub-nanomolar）的亲和力抑制PLCPs19。其存在于血流中，并且相信其在生理反应和病理反应过程中释放的蛋白酶的清除过程中起作用。重要的是，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C，以及一些家族成员，通过独特的结合位点以0.20nM的Ki抑制AEP20（图1）。因此，半胱氨酸蛋白酶抑制剂C代表用于合成泛内体（pan-endosomal）蛋白酶抑制剂的一种极佳的构架。组织蛋白酶D和E（内体天冬氨酰蛋白酶）被胃蛋白酶抑制剂A以0.1nM的Ki抑制21，胃蛋白酶抑制剂A是一种首次从放线菌属（Actinomyces）分离的异构肽。其主要缺点在于其在水性介质中的实质不溶解性21。然而，由于不容易得到更可溶的备选物，因此，其仍然广泛地使用，甚至用在基于细胞的测定中。已经进行了一些尝试来解决这一问题，诸如将胃蛋白酶抑制剂A缀合到去唾液酸糖蛋白(ASGP)上22，或者缀合到聚（乙二醇）上23，或者最近直接使其甘露糖基化，或者将其缀合到甘露糖基化的牛血清白蛋白上24。胃蛋白酶抑制剂的PEG化降低其抑制潜力400倍，并且缀合到甘露糖基化的BSA上降低Ki10倍，而缀合到ASGP上使得胃蛋白酶抑制剂没有活性，直至蛋白骨架被消化。胃蛋白酶抑制剂与肽或荧光结构部分的缀合没有显著改变其抑制潜力25。专利技术概述本专利技术部分是基于提供半胱氨酸蛋白酶抑制剂/天冬氨酰蛋白酶抑制剂缀合物，所述缀合物表现出多功能蛋白酶抑制活性。因此，在第一方面，提供包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂/胃蛋白酶抑制剂A缀合物的多功能蛋白酶抑制剂。本专利技术人已经观察到，可以通过将胃蛋白酶抑制剂A（其本身是非常难溶的）缀合到半胱氨酸蛋白酶抑制剂上，诸如半胱氨酸蛋白酶抑制剂C上来形成高度水溶性的分子。此外，这样的缀合物表现出针对下述蛋白酶种类中的至少两种的抑制活性：半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酰蛋白酶；和/或天冬酰胺酰内肽酶(AEP)。应该理解，本文所述的缀合物的各种生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其其他的生理学功能性衍生物也可以是适宜的，并且熟练的技术人员明白可以怎样制备此类分子。因此，术语多功能应该理解为意指本专利技术的缀合物具有针对至少两种酶学上不同的蛋白酶的抑制活性，诸如一种半胱氨酸蛋白酶，和一种天冬氨酰蛋白酶和/或天冬酰胺酰内肽酶，其抑制常数小于10μM。半胱氨酸蛋白酶抑制剂已经进展为抑制多种半胱氨酸蛋白酶，因此，尽管在任何一次仅可能接合一种蛋白酶分子（和一种AEP），但是其广泛地抑制这一类型的蛋白酶。有利地，本专利技术人已经能够提供这样的缀合物，所述缀合物在水溶液中显著可溶，其在pH范围为3-10、诸如4-8的水性缓冲液中，或在水本身中的溶解度大于50nM，但是典型地大于500nM，诸如在1μM的量级。这可以通过在半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子和胃蛋白酶抑制剂A之间结合肽结构部分而实现。典型地，任意增溶的肽的长度可以为2-30个氨基酸，并且应该是足够亲水的从而使疏水的抑制剂组分溶解。除了促进溶解之外，该肽还可以允许所述缀合物靶向所需的组织、细胞等。以这种方式，所述肽本身可以便利地为本领域已知的靶向肽，或者所述肽可以通过进一步修饰而能够结合一个或多个靶向结构部分。典型地，所述肽结构部分长度大于4个氨基酸残基，并且包含至少两个具有在中性pH下带电荷的侧链、和/或具有亲水性和/或极性侧链的氨基酸。优选地，所述肽可以包含一个或多个不影响所述缀合物抑制蛋白酶的能力的氨基酸残基，例如，在中性pH下带负电荷的氨基酸，或者具有羟基或羧酸侧链的那些氨基酸。可以使用非天然氨基酸，例如，在其侧链携带叠氮基或炔烃官能性的那些氨基酸，诸如可以通过另外的化学或酶促反应而被进一步修饰的那些氨基酸，例如通过铜催化的Huisgen环化加成反应或使用分选酶26。肽上的反应性侧链和/或修饰的残基可以促进抑制剂与另一结构部分（诸如靶向蛋白）的共缀合，由此促使向特定细胞类型和组织的递送（例如，进一步的详细描述参见正文和图8）。增溶标签的一个具体实例是FLAG-标签27，但是可以使用其他的肽。典型地，半胱氨酸蛋白酶抑制剂与胃蛋白酶抑制剂A的缀合可以通过在半胱氨酸蛋白酶抑制剂分子上存在的半胱氨酸，或者半胱氨酸蛋白酶抑制剂可以通过熟练的技术人员已知的诱变技术进行修饰，以引入能够促进与胃蛋白酶抑制剂A的缀合的半胱氨酸结构部分，任选地经由增溶肽。通过赖氨酸的修饰，或通过由熟练技术人员已知的方法引入的非天然本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多功能蛋白酶抑制剂，其包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂/胃蛋白酶抑制剂A缀合物，或其生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其他生理学功能性衍生物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2011.08.15 GB 1114017.51.一种多功能蛋白酶抑制剂，其包含半胱氨酸蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂A之间形成的缀合物，或所述缀合物的生理学可接受的盐、溶剂化物、酯、酰胺或其他生理学功能性衍生物，其中所述缀合物表现出针对下述蛋白酶种类中的至少两种的抑制活性：半胱氨酸蛋白酶，天冬氨酰蛋白酶；和/或天冬酰胺酰内肽酶(AEP)，所述缀合物包含在所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂和胃蛋白酶抑制剂A之间的肽结构部分，并且所述肽的长度为2-30个氨基酸，并且是充分亲水的以使疏水的抑制剂组分溶解。2.权利要求1所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂是半胱氨酸蛋白酶抑制剂C。3.权利要求1所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述缀合物具有小于10μM的针对所述至少两种蛋白酶的抑制常数。4.权利要求1所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述缀合物在水溶液中是可溶的，所述缀合物在pH范围为3-10的水性缓冲液中的溶解度大于50nM、500nM或1μM。5.权利要求4所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述水溶液是水。6.权利要求1所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述肽被设计成促进所述缀合物在水溶液中的溶解度。7.权利要求1所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述肽被设计成使所述缀合物能够靶向所需的组织或细胞。8.权利要求7所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述肽是已知的靶向肽，或者所述肽通过进一步的修饰能够结合一个或多个靶向结构部分。9.权利要求7所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述肽结构部分长度大于4个氨基酸残基，并且包含至少两个具有在中性pH下带电荷的侧链、和/或具有亲水性和/或极性侧链的氨基酸。10.权利要求9所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述靶向肽包含一个或多个不影响所述缀合物抑制蛋白酶的能力的氨基酸残基，并且包含在中性pH下带负电荷的氨基酸，或者具有羟基或羧酸侧链的那些氨基酸。11.权利要求9所述的多功能蛋白酶抑制剂，所述多功能蛋白酶抑制剂包含一个或多个非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含反应性侧链，其能够通过另外的化学或酶促反应被进一步修饰。12.权利要求10所述的多功能蛋白酶抑制剂，所述多功能蛋白酶抑制剂还包含一个或多个非天然氨基酸，其中所述非天然氨基酸包含反应性侧链，其能够通过另外的化学或酶促反应被进一步修饰。13.权利要求12所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中在所述肽上的反应性侧链和/或修饰的残基促进所述抑制剂与另一结构部分的共同缀合。14.权利要求13所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述另一结构部分是靶向结构部分或增溶结构部分。15.权利要求13所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述另一结构部分是增溶标签。16.权利要求15所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中所述增溶标签是FLAG-标签。17.权利要求1所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂与胃蛋白酶抑制剂A的缀合是通过在所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂上存在的半胱氨酸实现的，或者所述半胱氨酸蛋白酶抑制剂通过熟练的技术人员已知的诱变技术被修饰，从而引入能够促使与胃蛋白酶抑制剂A缀合的半胱氨酸结构部分。18.权利要求17所述的多功能蛋白酶抑制剂，其中半胱氨酸蛋白酶抑制剂与胃蛋白酶抑制剂A的缀合是通过赖氨酸、或通过引入到半胱氨酸蛋白酶抑制剂或胃蛋白酶抑制剂A中...

【专利技术属性】
技术研发人员：科林·沃茨，桑德尔·范卡斯特伦，
申请(专利权)人：敦提大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB