连接酶筛选测定制造技术

本发明专利技术涉及用于鉴定MYCBP2调节剂的方法。合适的调节剂通过MYCBP2泛素E3连接酶活性的调节而鉴定，其中，所述调节经由对两个催化性半胱氨酸(C4520和C4572)中的任一个的共价修饰，或通过阻碍新呈现的动态性的C4520所在的被称为介导环区的运动进行。本发明专利技术也涉及含有羟基的小分子及肽作为测定MYCBP2连接酶活性的代表底物的用途，和它们在鉴定调节剂的方法中的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】连接酶筛选测定专利
本专利技术涉及用于鉴定MYCBP2调节剂的方法。合适的调节剂通过MYCBP2泛素E3连接酶活性的调节而鉴定，其中，所述调节经由对两个催化性半胱氨酸(C4520和C4572)中的任一个的共价修饰，或通过阻碍新呈现的动态性的C4520所在的被称为介导环区的运动进行。本专利技术也涉及含有羟基的小分子及肽作为测定MYCBP2连接酶活性的代表底物的用途，和它们在鉴定调节剂的方法中的用途。
技术介绍
利用泛素(Ub)和泛素样修饰蛋白(Ubls)的蛋白修饰调节着真核生物的大多数方面。Ub/Ubl缀合是通过由E1活化(E1)，E2缀合(E2)和E3连接(E3)酶组成的酶级联实施的。缀合需要初始ATP-依赖性硫代酯化步骤和经由在E1s，E2s和E3s中的催化性半胱氨酸的毗邻的多达两个随后的转硫酯化步骤。泛素化通常被认为是赖氨酸残基的翻译后修饰。与E6-AP羧基末端(HECT)同源的E3经历与E2-泛素共价连接的中间体发生的催化性半胱氨酸-依赖性转硫醇反应，从而形成共价连接的E3-泛素中间体。此外，RING-between-RING(RBR)E3则具有规范的连接至辅助域的RING结构域。这包含了催化性半胱氨酸，使得杂合RING/HECT机制能够实现。泛素缀合酶级联被认为涉及广泛的疾病谱。尽管已经鉴别了许多不同的E2和E3酶和种类，但对这些酶中的一些所知甚少。因此，仍然需要分析或进一步分析这些酶的活性。本专利技术考虑这些问题而进行了设计。专利技术概述本专利技术基于由专利技术人对E3泛素连接酶MYCBP2的作用机制的研究。专利技术人出乎意料地发现，这种连接酶对于例如含有羟基的底物表现出酯化活性。专利技术人还认为，在E2缀合酶(E2)与在MYCBP2内的半胱氨酸残基之间发生转硫醇。这导致泛素的分子内中转，泛素从MYCBP2内的半胱氨酸残基到另一个半胱氨酸残基，然后到其底物。基于作用机制的鉴定可以研究活性MYCBP2蛋白与底物的相互作用，无论底物是人造的或内源性的。能够有利地活用这种相互作用，来对于它们对这种相互作用的效果而筛选测试物质。因此，本专利技术的目的提供基于这种相互作用的筛选测定。本专利技术的进一步目的在于鉴定和/或提供MYCBP2的调节剂，其用于治疗和/或预防，例如与轴突变性相关的损伤和病症的治疗和/或预防。可以被理解为，除非另有说明，本文所述的任何特征(包括任何随附的权利要求书和图)，可以与以下任何方面的任何组合相结合。根据第一方面，提供用于鉴定MYCBP2调节剂的方法，所述方法包括：a)使MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段与测试物质接触；b)提供探针，所述探针能够与活性MYCBP2的C4520，C4572和/或介导环区(残基4515-4531)相互作用；和c)检测与不存在所述测试物质时的相互作用的水平相比，探针与MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段相互作用的水平是否被调节。为了避免疑义，C4520存在于序列基序GEARCDAEA内，而C4572存在于序列基序AVFFCFGTT内。当靶向任一个经鉴定的半胱氨酸残基时，测试物质通常可以为小分子亲电体，如丙烯酰胺，丙烯腈或丙烯酸酯。由于能够与亲电体反应的硫醇基存在于半胱氨酸残基上，假定MYCBP2活性通过以下进行调节：a)利用亲电子的小分子配体共价修饰C4520；或b)利用亲电子的小分子配体共价修饰C4572；或测试小分子可通过破坏介导环区(残基4515-4531)的活动性发挥作用。介导环活动性的破坏可以通过例如，合适的生物物理技术如核磁共振(NMR)光谱，顺磁共振(EPR)光谱或荧光共振能量转移(FRET)测定。专利技术人已经确定，对于含有羟基的小分子及肽，MYCBP2具有意料不到的高且混杂的酯化活性。因此，使用小分子羟基化合物作为代表底物(proxysubstrates)可以用于鉴定亲电子的小分子配体。专利技术人在本文中将这样的代表底物描述为羟基探针。不意在以理论束缚，专利技术人认为全长天然MYCBP2蛋白的残基C4520和C4572为在E2-泛素和MYCBP2之间的转硫醇以及随后的泛素中转所需的，因此这些残基中的一个或多个将理解为包含活性位点。C4572在下游运转并与羟基探针相互作用。在一些实施方式中，活性位点至少包括残基C4520。在这样的实施方式中，可替换探针能够与残基C4520相互作用(如在WO2016/051174中报告的那些)。在当与不存在所述测试物质时的相互作用的水平相比，所述探针与MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段相互作用的水平被调节的实施方式中，测试物质将被理解为MYCBP2调节剂。MYCBP2为在人类发现的0.5MDa的蛋白，其包含C-末端RING结构域。该蛋白在发育的神经系统中的轴突引导和突触形成中起作用。在哺乳动物细胞中，该蛋白调节cAMP和mTOR信号途径，并可能另外调节自噬。在本专利技术的上下文中，将理解MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段是指核酸序列或其表达产物，例如DNA，cDNA，mRNA，蛋白或其肽片段。典型地，MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段包括蛋白或其肽片段。有利地，这实现在MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段与探针之间的蛋白-底物相互作用的筛选。如本文所用，活性MYCBP2被理解为指酶促活性MYCBP2蛋白。通过“进行相互作用”或“相互作用”，这应理解为是指所述探针与MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段的活性位点的缔合。本文描述的探针可以为被泛素分子共价修饰的。因此，本文使用的术语探针指分子，其能够与活性MYCBP2的一个或多个活性位点相互作用。将理解，如本文所用的MYCBP2的残基编号与天然全长MYCBP2规范的同种型(Uniprot登录号075592：http：//www.uniprot.org/uniprot/O75592.)关联，或如在Pao等.Nature.2018Apr；556(7701)：381-385中所描述。提及“C”为参考了标准氨基酸编码。因此，“C”指半胱氨酸残基。在本申请的首次提交之后，SWISSPROT对MYCBP2的入口已被修改为包括插入序列，所述插入序列在本文讨论的催化性区之外。然而，这造成影响，使序列编号以38个残基的方式改变。然而，专利技术人仍然保留了如在优先权申请和Pao等文献中描述的原始编号，并且技术人员读者通过向其添加38，能够容易地从更新的序列编号特定本文所描述的相关的半胱氨酸残基和环区。相互作用可包括羟基探针，或可替换探针对MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段的活性位点的特异性结合。作为酶，将被理解为存在活性MYCBP2的内源性底物。探针可包含MYCBP2的天然底物，即已知在体内能够与MYCBP2的活性位点相互作用的内源性底物。在一些实施方式中，探针包含活性MYCBP2的非内源性底物。通过术语非内源性，将被理解为其包括经修饰的内源性底物，以及尚未已知与MYCBP2在体内发生作用的底物(即人造的底物)。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于鉴定MYCBP2调节剂的方法，所述方法包括：/na)使MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段与测试物质接触；/nb)提供探针，所述探针能够与活性MYCBP2的C4520，C4572和/或介导环区(残基4515-4531)相互作用；和/nc)检测与不存在所述测试物质时的相互作用的水平相比，所述探针与MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段相互作用的水平是否被调节。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180316 GB 1804285.31.用于鉴定MYCBP2调节剂的方法，所述方法包括：
a)使MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段与测试物质接触；
b)提供探针，所述探针能够与活性MYCBP2的C4520，C4572和/或介导环区(残基4515-4531)相互作用；和
c)检测与不存在所述测试物质时的相互作用的水平相比，所述探针与MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段相互作用的水平是否被调节。


2.根据权利要求1所述的方法，其中，探针包括活性MYCBP2的非内源性底物。


3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，调节剂为抑制剂，且步骤c)包括检测与不存在所述测试物质时的相互作用的水平相比，所述探针与MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段相互作用的水平是否降低。


4.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述探针包括羟基，所述探针能够经由所述羟基与活性MYCBP2的C4520及任选地与C4572相互作用。


5.根据权利要求1～3中任一项所述的方法，其中，所述探针与MYCBP2的C4572相互作用，并包含根据下式(I)的活化生物分子：



其中，X为生物分子且EWG为吸电子基。


6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述方法不包括提供内源性MYCBP2底物，ATP，E1和/或E2。


7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中，所述探针缀合至表面。


8.根据权利要求4所述的方法，其中，相互作用包括所述羟基通过MYCBP2，其直系同源物，突变体或片段与泛素的酯化。


9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述探针包含肽。

【专利技术属性】
技术研发人员：萨特帕尔·弗迪，鲍冠全，
申请(专利权)人：敦提大学，
类型：发明
国别省市：英国;GB