以Taq酶对DNA和RNA病原进行同步PCR检测的方法技术

本发明专利技术涉及一种基因检测技术，具体地说，涉及一种Ｔａｑ酶对ＤＮＡ和ＲＮＡ病原进行同步ＰＣＲ快速扩增检测的方法。主要是采用蛋白质裂解试剂和煮沸法同步提取病毒核酸ＤＮＡ和ＲＮＡ，利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶本身的聚合酶活性和逆转录活性，以上述过程制备的病毒核酸为模板直接进行ＰＣＲ扩增，得到所需的各种目的核酸片断；经过电泳或杂交进行基因检测。本发明专利技术简化了提取核酸模板和逆转录的过程，节省了试剂成本，大大缩短了检测时间，减少了污染机会，为ＤＮＡ病毒和ＲＮＡ病毒的多重ＰＣＲ技术检测提供一种新方法，不仅适用于多种疾病病原基因的同步检测，更能满足临床实际的需要。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基因检测技术，具体地说，涉及以Taq酶(耐热DNA聚合酶)对DNA和RNA病原进行同步PCR(聚合酶链式反应)快速扩增检测的方法。现行的DNA病原的PCR检测方法多为将样品前处理后，经过碱、表面活性剂、蛋白酶等降解蛋白质外壳、细胞壁、细胞膜等后，用酚、氯仿-异戊醇抽提分离废蛋白，上清加醇类和无机盐沉淀核酸以提取核酸DNA或RNA，然后经过PCR扩增后经过电泳或杂交检测扩增产物，这一过程大约耗时8～36小时。1、下面以乙肝病毒(HBV)的血清PCR基因检测为例取待检血清100μl加入等体积的蛋白酶K(2mg/ml蛋白酶K溶于0.04molTris、0.01mol EDTA和1％SDS预孵育40℃30分钟)在40～56℃消化1～3小时，用等体积饱和酚提取1～3次，再用等体积氯仿-异戊醇(24∶1)提取1～3次；高速离心(8000～16000rpm)，取水相加入1/10体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠缓冲液和2～3体积的无水乙醇充分混合，于-20℃放置2小时以上；然后高速离心(8000～16000rpm)回收DNA，沉淀用75％冰冷乙醇离心清洗1～2次，真空干燥，溶于TE缓冲液。取5～10μl进行PCR扩增反应，电泳后观察结果。2、至于RNA病原的检测，模版的制备条件更为苛刻，它需要一套新的不同于DNA病原的试剂系统和操作程序，以丙肝病毒(HCV)的血清RT-PCR检测为例取待检血清100ul依次加入2倍体积的GSL消化液(4mol/L异硫氰酸胍、25mmol/L柠檬酸钠PH7.0、0.5％N-Lauroylsarcosine)、2倍体积用Tris-HCl pH8.0饱和的酚、等体积的水饱和的氯仿-异戊醇，每加一种试剂均应混和充分，反应体系中还要加入RNA酶抑制剂；高速离心取水相，加入1/10体积的3mol/L pH5.2的乙酸钠缓冲液，再加等体积异丙醇于-20℃放置2小时以上；然后高速离心回收RNA，沉淀用75％冰冷乙醇离心洗涤1～2次，真空干燥，溶于TE缓冲液。取5～10μl用于逆转录PCR扩增，添加RNA酶抑制剂后，在逆转录酶(AMVRT)的作用下，42～56℃.温浴30～60分钟，逆转录合成cDNA链，再进行PCR扩增，即RT-PCR.，然后电泳观察结果。由上述两个例子可见，传统方法反应体系和操作程序极为复杂，难于控制，容易出错，而且要耗费大量时间，浪费大量试剂，极不经济。然而，现实的情况是，有些病人的临床症状虽然相似，但引起疾病的病因或病原不同，有的是DNA病原引起，有些是RNA病原引起，有些既有DNA病原也有RNA病原，还有的需要同步检测多种DNA和RNA病原基因。如果根据现有资料使用引物探针，一种一种地分别进行PCR扩增检测未免盲目，无异于守株待兔，浪费了大量时间和试剂，病人也因得不到及时的诊断结果耽误了治疗。本专利技术的目的是这样实现的其采用的是蛋白质裂解试剂，该蛋白质裂解试剂组成为1％～10％的十二烷基硫酸钠(SDS)、2～20％NP-40、1～10％吐温-20等表面活性剂与Tris或磷酸缓冲液的两两组合，再加入RNA酶抑制剂焦碳酸二乙酯(DEPC)；取裂解试剂与病理标本共同煮沸5～30分钟，离心取上清即可同步提取病毒核酸DNA和RNA，以此上清为模板，无需加入逆转录酶，利用Taq DNA聚合酶本身的聚合酶活性和逆转录活性(其作用类似逆转录酶，活性温度一般为65℃～68℃，在Mn2+存在时，其逆转录活性更高的特性)，以提取的病毒核酸为模板直接进行PCR扩增，得到所需的各种目的核酸片断，经过电泳或杂交认定后达到基因检测目的。它可以为DNA病原和RNA病原基因进多重PCR(一次反应，加入多对引物，扩增多种基因)扩增后，同步检测提供一种迅速简便的方法。检验流程为模板制备、PCR扩增、检测。本专利技术具有以下优点和积极效果。简化了提取核酸模板和逆转录的过程，节省了试剂成本，大大缩短了检测时间，减少了污染机会，为DNA病毒和RNA病毒的多重PCR技术检测提供一种新方法。该方法适用于多种疾病病原基因的同步检测，更能满足临床实际的需要。具体实施例方式1、实施例一 HBV、HCV病毒核酸同步检测根据已发布HBV、HCV基因组序列高度保守区设计特异性引物，交给北京赛百盛公司合成。dNTP、TaqDNA聚合酶、10×buffer(扩增缓冲液)均购于华美生物工程有限公司。配置我们自制的蛋白质裂解缓冲液。HBV上、下游引物分别是P1 5’-ACATACTCTGTGGAAGGCTGGC-3’P2 5’-TATCCCATGAAGTTAAGGGAGTAG-3’扩增片断长度约430bp。HCV上、下游引物分别是P3 5’-TGCACGGTCTACGAGACCT-3’P4 5’-GCCATGGCGTTAGTATGAGT-3’，扩增片断长度约260bp。实验流程①血样采集 本实验血清样品HBV和HCV共感染的阳性血清由华中科技大学附属协和医院提供。②模板制备 取待检血清70μl于PCR反应薄壁管中，加入自制的蛋白质裂解缓冲液(2％NP40+0.1×TE)30μl，在100℃煮沸5～15min，然后在台式心机上15000r/min离心3～10min。收集上清20μl于另一个PCR反应薄壁管中，即为感染病毒核酸模版提取液。③PCR扩增在收集上清管(20μl)内加入10×buffer 10μl、dNTP(10mM)2μl、 引物P1 P2各1.5μl，P3 P4各2μl、TaqDNA聚合酶1单位，补水至100μl，混匀。在94℃预变性5分钟后，于94℃45秒、48℃45秒、72℃45秒的条件下扩增35个循环，最后于72℃延伸10分钟。④检测 取10μl PCR产物在电压50伏，2％的琼脂糖凝胶电泳40～60分钟，在紫外灯下观察，其扩增效果明显，大小适合，条带清晰。有明显的两条带出现，与标准的HBV和HCV阳性血清扩增条带对比，其条带相符。2、实施例二 黄病毒的快速检测黄病毒是一类单股正链RNA病毒。黄病毒引起的疾病在临床上的表现，包括由登革病毒(Den)引起的无特殊部位的全身性感染登革热(DF)、登革出血热和休克综合征(DHF/DSS)；由黄热病毒(YF)引起的全身性感染(但主要表现为出血和肝炎)，和由乙型脑炎病毒(JBE)，圣路易脑炎病毒(SLE)，西尼罗病毒(WN)和蜱传脑炎病毒(TBE)等引起的脑炎和脑脊髓炎等，我国目前已证实的黄病毒有乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、登革热病毒等。根据已发布的四类黄病毒基因组序列高度保守区设计特异性引物，交给北京赛百盛公司合成。dNTP、TaqDNA聚合酶、10×buffer均购于华美生物工程有限公司。配置自制的蛋白质裂解缓冲液。实验流程①血样采集 本实验血清样品由武汉协和医院提供，采集疑为黄病毒引起的病人血清。②模板制备 取待检血清70μl于PCR反应薄壁管中，加入自制的蛋白质裂解缓冲液30μl，在99.9℃煮沸10～15min，然后在台式心机上15000r/min离心10min。收集上清20μl于另一个PCR反应薄壁管，即感染病毒核酸提取液。③PCR扩增 在收集上清管(20μl)内加入10×buffer 10μl、dNTP(10m本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种以Ｔａｑ酶对ＤＮＡ和ＲＮＡ病原进行同步ＰＣＲ检测的方法，其特征在于：①蛋白质裂解试剂组成为：１％～１０％的十二烷基硫酸钠（ＳＤＳ）、２～２０％ＮＰ－４０、１～１０％吐温－２０表面活性剂与Ｔｒｉｓ或磷酸缓冲液的两两组合，再加入ＲＮＡ酶 抑制剂焦碳酸二乙酯（ＤＥＰＣ）；②采用蛋白质裂解试剂和煮沸法同步提取病毒核酸ＤＮＡ和ＲＮＡ；③利用Ｔａｑ ＤＮＡ聚合酶本身的聚合酶活性和逆转录活性，以上述过程制备的病毒核酸为模板直接进行ＰＣＲ扩增，得到所需的核酸片断；④得到核酸 片断后，经过电泳或杂交进行基因检测；⑤检验流程为模板制备、ＰＣＲ扩增、检测。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王业富，庞代文，沈钧涛，
申请(专利权)人：武汉大学，
类型：发明
国别省市：83[中国|武汉]