用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂及其应用制造技术

本发明专利技术公开了用于检测循环血液中ROR1蛋白的试剂及其应用。其中，用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂。该试剂包括：ROR1抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。本发明专利技术利用ROR1只在癌细胞表达，而不在正常成人组织细胞表达这一特性，应用本发明专利技术的试剂检测循环血液中从原发肿瘤病灶脱落到血中的循环肿瘤细胞或肿瘤干细胞表达的ROR1蛋白，克服了传统方法的局限性，大大提高了循环肿瘤细胞检测的准确性和可靠性。本发明专利技术的试剂能够用于帮助检测肿瘤病人循环血中的肿瘤细胞，这对于肿瘤的疾病诊断，治疗效果的评估及癌转移监测是一个潜在的突破点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质检测
，具体而言，涉及一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂及其应用。
技术介绍
在肿瘤的生长过程中，肿瘤细胞会从原发病灶脱落进入到循环系统中成为“循环肿瘤细胞”，并且作为一种检测肿瘤特异的检验指标。肿瘤转移是循环肿瘤细胞从原发肿瘤病灶进入到血液循环之后会依附到远端的组织开始生长发育成新的肿瘤。大量临床数据表明，循环肿瘤细胞是造成肿瘤患者死亡的主要原因。最近开发出来的对于循环肿瘤细胞的分离方法对肿瘤的早期诊断有着非常重要的意义。重要的是循环肿瘤细胞的定量可以用来预测肿瘤转移的后果。另外，肿瘤干细胞（循环肿瘤细胞的一种，会导致肿瘤的产生）可以被用于肿瘤转移以及复发的诊断。因此，循环肿瘤细胞的检测已被公认为可有效地应用于体外早期癌症诊断，化疗药物的快速评估，个体化治疗包括临床筛药、耐药性的检测，肿瘤复发的监测以及肿瘤新药物的开发等。然而，如何找到敏感特异和稳定的循环肿瘤细胞标记物以准确识别循环肿瘤细胞是目前困扰开发循环肿瘤细胞检测技术的难题。捕获循环肿瘤细胞的方法报道很多，基本分为三大类：抗体直接捕获，富集，过滤。相比之下，如何准确识别鉴定分离出的细胞为循环肿瘤细胞报道甚少，主要原因是缺乏稳定特异的肿瘤细胞识别物。现有的包括美国药监局批准的“细胞寻找系统（CellSearch System）”方法都采用细胞角蛋白（CK）和/或EpCAM阳性，CD45阴性的有核细胞作为识别循环肿瘤细胞的判断标准。但是越来越多的试验证明并非所有癌细胞都表达EpCAM。癌症发展进程中或在转移时，某些癌症的EpCAM表达增高而某些癌症的EpCAM降低。癌细胞特别在由上皮细胞源性到间质细胞性转换期间，CK和EpCAM表达都降低。EpCAM表达低的癌细胞容易从实体肿瘤脱落，而特殊结构功能的细胞角蛋白会促使癌细胞更具可塑性和迁移性。虽然人们试图用更多的肿瘤标记物抗体来增强鉴定循环肿瘤细胞的准确性和敏感性，由于这些肿瘤表达的蛋白或者只在部分人群中表达或者随肿瘤发展的不同阶段而改变，所以检测成本增加又解决不了根本问题。ROR归属于膜表面氨酸激酶家族，有ROR1和ROR2成员，最先在脑胶质瘤细胞中发现。两者的基因分别在染色体1和9号上，编码104KD的蛋白。一直以来认为两个ROR受体都为“孤儿”受体，直到最近才发现Wnt5A是ROR2的内原性配体。然而ROR1的内原性配体至今还没找到。ROR在胚胎神经器官发育表达很高而在成熟后消失。近来发现ROR1在急性和慢性白血病细胞中表达并对癌细胞的生长起决定作用。然而如何监测ROR1以及在肿瘤诊断、治疗、转移中的应用进展甚少。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种用于检测循环血液中肿瘤细胞表达的ROR1蛋白的试剂及其应用，以解决现有缺乏简便，灵敏和可靠的癌症早期诊断和癌症转移监测的技术问题。为了实现上述目的，根据本专利技术的一个方面，提供了一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂。该试剂包括：ROR1抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。进一步地，核染料为DAPI；淋巴细胞识别抗体为CD45。进一步地，ROR1抗体为单克隆抗体、多克隆抗体或免疫血清。根据本专利技术的另一个方面，提供了一种用于检测循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂盒。该试剂盒包括如权利要求1或2的试剂。根据本专利技术的再一个方面，提供一种上述试剂在制备诊断癌症的试剂盒中的应用。根据本专利技术的再一个方面，提供一种上述试剂在体外检测循环肿瘤细胞ROR1蛋白的应用。根据本专利技术的再一个方面，提供一种帮助癌症诊断的检测方法。该方法包括以下步骤：1）从外周血或生物体液中分离非红细胞非白细胞的混合细胞群；2）检测细胞是否表达ROR1基因和蛋白；以及3）根据ROR1基因和/或蛋白表达信息帮助癌症诊断。根据本专利技术的再一个方面，提供一种用于帮助治疗方案的制定、评估癌症治疗效果和存活率的方法。该方法包括以下步骤：1）从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离肿瘤细胞；2）监测肿瘤细胞中ROR1基因和/或蛋白表达水平；以及3）根据ROR1基因和/或蛋白表达水平帮助治疗方案的制定，判断癌症治疗效果和存活率，其中治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。根据本专利技术的再一个方面，提供一种用于帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性的方法。该方法包括以下步骤：1）从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离循环肿瘤细胞；2）监测循环肿瘤细胞中ROR1基因和/或蛋白表达水平；以及3）根据ROR1基因和/或蛋白表达水平帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性，其中治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。根据本专利技术的再一个方面，提供一种帮助癌症诊断检测方法、帮助评估癌症治疗效果和存活率的方法或帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性，其中，从生物体液中分离肿瘤细胞采用选自抗体直接捕获法、循环肿瘤细胞富集分离方法、过滤法中的一种；优选地，生物体液包括循环血液、骨髓、胸水、脑脊液、淋巴液、腹水、尿液、唾液、痰液、冲灌液、精液、腺体分泌物、炎性渗出物；优选地，ROR1蛋白检测方法包括：免疫荧光法如荧光显微镜、流式细胞技术、微流体、免疫沉淀、西点墨点法、，酶联免疫吸附测定、放射免疫分析法、和质谱方法；优选地，通过聚合酶链式反应和/或逆转录聚合酶链式反应检测ROR1基因的表达水平；优选地，循环血液取自正常人或癌症病人，癌症病人包括患有上皮来源的实体瘤的病人；优选地，癌症病人包括患肺癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌、前列腺癌、膀胱癌、睾丸癌、食管癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、脑癌、神经胶质瘤、胰腺癌、和/或皮肤癌的病人；优选地，通过ROR1抗体检测ROR1的蛋白表达水平，采用荧光标记进行标记，荧光标记采用免疫组织化学染色、免疫荧光抗体染色及其后续的借助荧光显微镜和/或荧光分析技术进行的定性与定量分析。根据本专利技术的再一个方面，提供一种用于抗肿瘤药物或抑制癌细胞转移的药物筛选的方法。该方法包括：1）从来自患癌的实验动物的生物体液中分离循环肿瘤细胞；2）监测循环肿瘤细胞中ROR1基因或蛋白表达水平；以及3）根据预定频率和用量和给药时间给予患癌的实验动物候选化合物，4）再次从来自给予候选化合物的患癌的实验动物的生物体液中分离循环肿瘤细胞；5）再次监测来自给予候选化合物的实验动物的循环肿瘤细胞中ROR1基因或蛋白表达水平，其中循环肿瘤细胞中ROR1基因或蛋白表达水平低于在步骤2）中所监测的循环<本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂，其特征在于，包括：ROR1抗体、缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测外周血中循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂，其特征在于，包括：ROR1抗体、
缓冲液、标记物、核染料及淋巴细胞识别抗体。
2.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述核染料为DAPI；淋巴细胞识别抗体为
CD45。
3.根据权利要求1所述的试剂，其特征在于，所述ROR1抗体为单克隆抗体、多克隆抗体
或免疫血清。
4.一种用于检测循环肿瘤细胞ROR1蛋白的试剂盒，其特征在于，包括如权利要求1至3
中任一项所述的试剂。
5.一种如权利要求1至3中任一项所述的试剂在制备诊断癌症的试剂盒中的应用。
6.一种如权利要求1至3中任一项所述的试剂在体外检测循环肿瘤细胞ROR1蛋白的应用。
7.一种帮助癌症诊断的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）从外周血或生物体液中分离非红细胞非白细胞的混合细胞群；
2）检测所述细胞是否表达ROR1基因和/或蛋白；以及
3）根据所述ROR1基因和/或蛋白表达信息帮助癌症诊断。
8.一种用于帮助治疗方案的制定、评估癌症治疗效果和存活率的方法，其特征在于，包括
以下步骤：
1）从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离肿瘤细胞；
2）监测所述肿瘤细胞中ROR1基因和/或蛋白表达水平；以及
3）根据所述ROR1基因和/或蛋白表达水平帮助治疗方案的制定，判断所述癌症治疗
效果和存活率，
其中所述治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。
9.一种用于帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能性的方法，其特征在于，包括以下步
骤：
1）从来自经治疗之后的癌症患者的全血或生物体液中分离循环肿瘤细胞；
2）监测所述循环肿瘤细胞中ROR1基因和/或蛋白表达水平；以及
3）根据所述ROR1基因和/或蛋白表达水平帮助评估癌细胞转移、耐药性和复发可能
性，
其中所述治疗选自手术、放射治疗、药物治疗、靶向治疗、或它们的联合疗法。
10.根据权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：张宝弘，林平，
申请(专利权)人：张宝弘，
类型：发明
国别省市：上海;31