猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法。该试纸包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原和抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；金标探针区包被金标探针，为胶体金标记的小鼠抗猪IgG抗体；固相化抗原和抗体区依次有检测线T1包被猪伪狂犬病毒gE蛋白、检测线T2包被猪伪狂犬病毒gB蛋白、检测线T3包被猪伪狂犬病毒gD蛋白和对照线C包被羊抗小鼠IgG抗体。本发明专利技术的试纸检测快速，准确率高，特异性强，携带、操作简便，可同时用于PRV野毒感染及疫苗免疫的鉴别诊断和PRV疫苗免疫效果的评估。

【技术实现步骤摘要】

    本专利技术涉及一种检测试纸及制备方法，具体涉及一种猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸及制备方法。
技术介绍
伪狂犬病（Pseudorabies）是由伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）引起的包括多种家畜和野生动物共患的一种急性传染病。猪是伪狂犬病最主要的贮存宿主和传染源。健康猪与病猪、带毒猪直接接触可感染本病。成年猪常为隐性感染；受感染的怀孕母猪则出现流产、死胎、弱胎和木乃伊胎等病征；受感染的新生仔猪出现发热及神经症状，甚至衰竭死亡，死亡率可达100%。自1902年首次在美国发现伪狂犬病以来，该病己在全球范围内流行。我国自1947年首次发现伪狂犬病以来，至2006年已有31个省（区）、市有关于伪狂犬病的报道。伪狂犬病对我国乃至全球养猪业的健康发展造成了巨大的经济损失，成为严重危害养猪业健康发展的重大传染病之一。在PRV与宿主的相互作用中，病毒的gB和gD囊膜糖蛋白起着重要作用。病毒囊膜糖蛋白gB和gD不仅介导病毒对靶细胞的感染，也是被感染的宿主免疫系统识别的主要抗原。在疱疹病毒中gB蛋白属于最保守的糖蛋白之一，该糖蛋白能诱导机体产生高滴度的中和抗体，且是病毒感染过程中的必须成分。PRV gD为病毒感染必需的结构蛋白，该蛋白参与病毒的穿透过程，是一种重要的中和抗原，也是保护性抗体的主要目标。研究表明，gD基因是预防猪伪狂犬病重组腺病毒疫苗和核酸疫苗的重要靶序列，可以作为血清学诊断抗原。gE糖蛋白是PRV的一种十分重要的糖蛋白，在决定病毒的毒力及神经嗜性等方面起着重要作用，但gE不是PRV增殖所必需的蛋白，常作为缺失的候选基因。目前，常用的检测PRV的方法包括乳胶凝集（LAT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、聚合酶链反应（PCR）等。胶体金免疫层析法作为一种日渐成熟的实验检测方法，以其特异性强、成本低，操作简便，结果可靠、可单份或成批测定、不需任何仪器等优点已被广泛接受。目前已有报道的PRV检测试纸多只能检测针对单一蛋白抗原（gE）的抗体，测试者往往需要借助二次检测才能进一步确定在没有野毒感染的情况下，是否存在PRV抗体。 
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸。该试纸采用胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗做探针，包被猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗原和羊抗小鼠IgG抗体进行抗猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的检测。本专利技术的另一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法。本专利技术的再一目的在于提供上述猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸的使用方法。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸，包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原和抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的金标探针区包被金标探针，为胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗，标记量优选为每mL胶体金标记5～20μg小鼠抗猪IgG单抗，金标探针包被量优选为5～10μL；所述的固相化抗原和抗体区（自金标探针区至吸水区方向）依次有检测线T1、T2、T3和对照线C；所述的检测线T1包被有猪伪狂犬病毒gE蛋白，包被量优选为0.5～5μg；检测线T2包被有猪伪狂犬病毒gB蛋白，包被量优选为0.5～5μg；检测线T3包被有猪伪狂犬病毒gD蛋白，包被量优选为0.5～5μg；对照线C包被有羊抗小鼠IgG抗体，包被量优选为为1～10μg。所述的支撑板的材料优选为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料优选为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料优选为聚酯膜；所述的固相化抗原和抗体区的材料优选为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料优选为吸水滤纸。所述的猪伪狂犬病毒gE、gB和gD蛋白抗原可按照常规的基因工程方法进行制备或表达，这些都是本领域技术人员所能掌握或通晓的。上述猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，包括如下步骤：将胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上依次包被检测线T1（包被猪伪狂犬病毒gE蛋白）、T2（包被猪伪狂犬病毒gB蛋白）、T3（包被猪伪狂犬病毒gD蛋白）和对照线C（包被羊抗小鼠IgG抗体）；将玻璃纤维膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到支撑板上得到猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸。更优选的，所述的猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法包括如下步骤：（1）胶体金标记小鼠抗猪IgG单抗的方法：分别取半径为10～40nm浓度为0.01%的胶体金20mL及小鼠抗猪IgG单抗100～400μg，在pH值8.5～9.2的条件下通过磁力搅拌振荡使其结合，加牛血清白蛋白（BSA）和聚乙二醇20000（PEG20000）作为稳定剂，且使得BSA最终质量浓度为0.1～5%，PEG20000最终质量浓度为0.01～0.1%，采用离心法除去未结合的小鼠抗猪IgG单抗和未稳定的胶体金颗粒及其凝集物，在离心管底部的深红色沉淀为胶体金－小鼠抗猪IgG单抗复合物。（2）将胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗喷涂于聚酯膜上：用20mL含1%BSA的PBS（0.01M，pH值7.4）分别洗涤胶体金－小鼠抗猪IgG单抗复合物，离心除去上清液，得到深红色沉淀，纯化后的沉淀用2mL含1%BSA的PBS溶解，用喷涂设备涂于聚酯膜上，冻干。（3）硝酸纤维素膜的包被：在硝酸纤维素膜依次包被检测线T1、T2、T3和对照线C；检测线T1包被猪伪狂犬病毒gE蛋白的量为0.5～5μg；检测线T2包被猪伪狂犬病毒gB蛋白的量为0.5～5μg；检测线T3包被猪伪狂犬病毒gD蛋白的量为0.5～5μg；对照线C包被羊抗小鼠IgG抗体的量为1～10μg；每条线宽1～3mm。（4）试纸组装：用粘上一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板作为支撑载体，上面依次铺设玻璃纤维膜、金标探针的聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸，外面用胶带包封制成。除非另有说明，本专利技术涉及液体与液体之间的百分比时，所述的百分比为体积/体积百分比；本专利技术涉及液体与固体之间的百分比时，所述百分比为体积/重量（mL/g）百分比；本专利技术涉及固体与液体之间的百分比时，所述百分比为重量/体积（g/mL）百分比；其余为重量/重量百分比。上述猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸的使用方法，包括如下步骤：将该试纸的样品吸收区一端浸入待检血清样品中，5～10分钟后判读结果：对照线C出现红色，表示试纸有效；检测线T1、T2、T3出现红色，分别表明伪狂犬病毒gE、gB、gD抗体阳性；检测线T1、T2、T3无颜色出现，表明血清中没有对应的伪狂犬病毒gE、gB、gD抗体或抗体量很低。本专利技术相对于现有技术具有如下优点和效果：（1）检测快速：检测时间本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原和抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的金标探针区包被金标探针，为胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗；所述的固相化抗原和抗体区有包被猪伪狂犬病毒gE蛋白的检测线T1、包被猪伪狂犬病毒gB蛋白的检测线T2、包被猪伪狂犬病毒gD蛋白的检测线T3和包被羊抗小鼠IgG抗体的对照线C。

【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：包括样品吸收区、金标探针区、固相化抗原和抗体区、吸水区和支撑板，样品吸收区、金标探针区、固相化抗原抗体区和吸水区铺设在支撑板上并依次相互部分重叠；所述的金标探针区包被金标探针，为胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗；所述的固相化抗原和抗体区有包被猪伪狂犬病毒gE蛋白的检测线T1、包被猪伪狂犬病毒gB蛋白的检测线T2、包被猪伪狂犬病毒gD蛋白的检测线T3和包被羊抗小鼠IgG抗体的对照线C。
2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的支撑板的材料为粘有一层聚氯乙烯衬膜的聚乙烯板；所述的样品吸收区的材料为玻璃纤维膜；所述的金标探针区的材料为聚酯膜；所述的固相化抗原和抗体区的材料为硝酸纤维素膜；所述的吸水区的材料为吸水滤纸。
3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸，其特征在于：所述的金标探针的标记量为每mL胶体金标记5～20μg小鼠抗猪IgG单抗，金标探针的包被量为5～10μL；所述的检测线T1包被猪伪狂犬病毒gE蛋白的量为0.5～5μg，检测线T2包被猪伪狂犬病毒gB蛋白的量为0.5～5μg，检测线T3包被猪伪狂犬病毒gD蛋白的量为0.5～5μg，对照线C包被羊抗小鼠IgG抗体的量为1～10μg。
4.权利要求1-3任一项所述的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下步骤：将胶体金标记的小鼠抗猪IgG单抗喷涂于聚酯膜上；在硝酸纤维素膜上包被检测线T1、T2、T3和对照线C；将玻璃纤维膜、聚酯膜、硝酸纤维素膜和吸水滤纸组装到支撑板上得到猪伪狂犬病毒gE、gB和gD抗体的胶体金免疫层析检测试纸。
5.根据权利要求4所述的胶体金免疫层析检测试纸的制备方法，其特征在于包括如下...

【专利技术属性】
技术研发人员：廖园园，漆世华，秦伟，朱薇，刘洁，孙庆歌，郑良益，谢红玲，温文生，冯钊，
申请(专利权)人：武汉中博生物股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42