由木质素衍生的化合物生物生产芳香族化学品制造技术

本文所提供的教导总体而言涉及使用酶的生物转换工艺将木质素衍生的化合物转换为有价值的芳香族化学品的方法。本文所述的教导提供了以下选择：(i)对在木质素级份中存在的毒性化合物耐受的宿主细胞；(ii)可以在将木质素级份生物转换为芳香族化学品产物中作为酶使用的多肽；(iii)可以用于转化宿主细胞从而在木质素级份的生物转换中表达作为酶的所选多肽的多核苷酸；以及(iv)表达酶的转化子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】R·查特吉 K·赞 K·米歇尔 G·刘 相关申请的交叉引用 本申请要求9/15/2010提交的美国临时申请No.61/403,440和10/25/2010提交的美国临时申请61/455,709的优先权，这些申请在此均以引用方式全文并入本文。 序列表 本申请与序列表的ASCII规格的文本文件一起提交。所附文件的名称为ALIGP004US01_SEQLIST_AS-FILED.txt，并且该文件于2011年8月29日创建，大小为813KB，并在此以引用方式全文并入本文。由于ASCII规格的文本文件作为§1.821(c)所必需的纸版和§1.821(e)所必需的CRF，所以根据联邦公报(Federal Register)/Vol.74，No.206/2009年10月27日星期二，部分I的37C.F.R.§1.821(f)，不再需要指明序列表的纸版和CRF拷贝是等同的陈述。 
技术介绍

本文提供的教导总体而言涉及使用酶，通过生物转变工艺将木质素衍生的化合物转变为有价值的芳香族化学品的方法。 相关领域的描述当前，全世界整体性地依赖石油作为用于制造燃料和化学品的可能耗尽的原料。使用石油的问题是如此公知的，并记录为它们对于世界人口而言几乎已经成为陈词滥调。简言之，基于石油的工艺是脏且危险的。与石油应用相关的环境影响是已知的，例如包括空气污染、全球变暖、提取产生的损伤、油泄露、油球以及对人、家畜和野生生物的健康危害。 例如，油的精炼是主要生产汽油的基于石油的工艺。然而，它们还广泛地用于生产在药物、农用化学品、食品原料和塑料的制造中有价值的且鲜有人知的化学产物。该市场范围的清洁绿色备选物受到全球范围的重视。 生物加工可以将清洁绿色的备选物提供给基于石油的工艺，所述的生物加工为使用有机体、细胞、细胞器或酶来进行商业化工艺的加工方法。例如，生物精炼可以生产例如化学品，热和动力，以及食品、饲料、燃料和工业化学产物。生物精炼的实例可以包括湿磨和干磨玉米粉、制浆和造纸厂以及生物燃料工厂。在制革过程中，使用蛋白酶软化毛皮并除去头发。在酿造中，在发芽大麦中使用淀粉酶。在干酪制造中， 使用凝乳酶来凝结蛋白质(以密尔计)。例如，近来，生物燃料工厂成为焦点，其自然而然地集中与燃料产物来替代基于石油的燃料，结果不再研发同样依赖于基于石油工艺的其他有价值的化学产物。 由此，生物精炼使用酶来将天然产物转换为有用的化学品。天然产物(例如在制浆和造纸厂中使用的木材)包含纤维素、半纤维素和木质素、硬木的典型组成范围可以为大约40-44％纤维素、大约15-35％半纤维素、以及大约18-25％木质素。同样，软木的典型组成范围可以为大约40-44％纤维素、大约20-32％半纤维素、以及大约25-35％木质素。由于所有的生物燃料均得自纤维素质的生物精炼，其中重要的原材料为葡萄糖，其衍生自纤维素，所以木质素保持未充分利用。在自然界中，木质素为芳香族化合物的单一的最丰富的来源，并且木质素的用途目前局限于低价值的应用，例如燃烧生成用于生物精炼设备的过程热和能量。备选地，木质素作为动物饲料或肥料的天然成分被出售。然而，有趣的是木质素为基于芳香族核心结构的唯一的植物生物质成分，并且所述的核心结构在工业化学品的生产中是有价值的。技术人员理解的是：不幸地，此类木质素应用的主要问题仍保留：存在于生物精炼的木质素级份中的芳香族化合物包括抑制工业微生物生长和存活的毒性化合物。至少鉴于这些原因，使用工业微生物将木质素级份转换为工业产物的工艺仍未成功。 基于上文所述，技术人员理解的是：(i)在生产有价值的化学产物(包括主要的市场，例如药物、农用化学品、食品原料和塑料)中，清洁绿色替代基于石油的工艺；(ii)有益地利用在木质素中得到的大量且可再生的天然来源，其目前为工业废物流，其作为工业原料是未经充分利用的；(iii)选择对原料的木质素级份中存在的毒性化合物耐受的宿主细胞；(iv)选择可以在木质素级份生物转换为有价值的化学产物的过程中用作酶的多肽；(v)选择可以用于转化宿主细胞从而在木质素级份转换为有价值的化学产物的过程中表达所选择的多肽的宿主细胞；(vi)包含表达酶的转化子的系统，其中所述的转化子可以用于(a)表达酶，同时与木质素级份直接接触；或者(b)表达由细胞进行提取的酶，其后将提取的酶与木质素级份直接接触；以及(vii)在高于基于石油工艺的收益下生产有价值的化学产物的清洁绿色方法。 专利技术概述 本专利技术总体而言涉及生产用于将木质素衍生的化合物生物转变为有价值的芳香族化学品的酶的重组方法。在一些实施方案中，所述的教导涉及分离的重组多肽，其包含与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列。该序列可以保留残基T19，I20，S21，P22，V24，W25，T27，K28，Y29，A30，H33，K34，G35，F36，D39，I40，V41，P42，G43，G44，F45，G47，I48，E50，R51，T52，G53，G54，K100，A101，N104，V111，G112，M115，F116，P166，W107，Y184，Y187，R188，G191，G192和F195。 在一些实施方案中，所述的教导涉及分离的重组多肽，其包含SEQ ID NO：101；或者该序列的保守残基以外的保守性取代。保守的残基可以包括T19，I20，S21，P22，V24，W25，T27，K28，Y29，A30，H33，K34，G35，F36，D39，I40，V41，P42，G43，G44，F45，G47，I48，E50，R51，T52，G53，G54；K100，A101，N104，V111，G112，M115，F116，P166， W107，Y184，Y187，R188，G191，G192和F195。 在一些实施方案中，所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶，其包含与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列。该序列可以保留残基T19，I20，S21，P22，V24，W25，T27，K28，Y29，A30，H33，K34，G35，F36，D39，I40，V41，P42，G43，G44，F45，G47，I48，E50，R51，T52，G53，G54；K100，A101，N104，V111，G112，M115，F116，P166，W107，Y184，Y187，R188，G191，G192和F195；其中所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。 在一些实施方案中，所述的教导涉及分离的重组谷胱甘肽S转移酶，其包含与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列；其中所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。 在一些实施方案中，所述的教导涉及分离的重组多肽，其包含：(i)长度范围为大约279至281的氨基酸；(ii)由以下部分构成的第一氨基酸区域：得自SEQ ID NO：101的残基19-54，或其除保守残基T19，I20，S21，P22，V24，W25，T27，K28，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种分离的重组多肽，其包含：与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列，该氨基酸序列保留了SEQ ID NO：101的残基1，2，4‑8，10‑12，14，17，19‑22，24，25，27‑37，39，41‑54，57，58，60，62‑67，69‑73，75，77‑80，82‑87，89，100，102，103，104，105，107，110‑114，117，212，122，124‑130，133，134，137‑139，148，149，151‑156，159，160，166‑168，170，173，174，178‑181，184，185，187‑189，198‑201，204，205，207，210‑216，219，222，223，226‑232，235‑239，242‑246，249，251，254，257，264，266，267，270，275和278；其中除了所述的保守残基以外的氨基酸取代为保守性取代；以及所述的氨基酸序列起到切割β‑芳基醚的作用。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.09.15 US 61/403,400;2010.10.25 US 61/455,7091.一种分离的重组多肽，其包含：
与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列，该氨基酸序
列保留了SEQ ID NO：101的残基1，2，4-8，10-12，14，17，19-22，24，25，
27-37，39，41-54，57，58，60，62-67，69-73，75，77-80，82-87，89，100，102，103，
104，105，107，110-114，117，212，122，124-130，133，134，137-139，148，149，
151-156，159，160，166-168，170，173，174，178-181，184，185，187-189，
198-201，204，205，207，210-216，219，222，223，226-232，235-239，242-246，
249，251，254，257，264，266，267，270，275和278；
其中除了所述的保守残基以外的氨基酸取代为保守性取代；以及
所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
2.一种分离的重组多肽，其包含：
与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列，该氨基酸序
列保留了SEQ ID NO：101的残基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，
50-54；100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192和
195；
其中除了所述的保守残基以外的氨基酸取代为保守性取代。
3.权利要求2所述的分离的重组多肽，其中所述的氨基酸序列起到切
割β-芳基醚的作用。
4.一种分离的重组多肽，其包含：
SEQ ID NO：101；或者除了SEQ ID NO：101的保守残基19-22，24，25，
27-30，33-36，39-45，47，48，50-54；100，101，104，111，112，115，116，166，

\t107，184，187，188，191，192和195以外的保守性取代。
5.一种分离的重组谷胱甘肽S转移酶，其包含：
与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列，该氨基酸序
列保留了SEQ ID NO：101的残基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，
50-54；100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，192和
195；
其中所述的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
6.一种分离的重组谷胱甘肽S转移酶，其包含：
与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性的氨基酸序列；其中，所述
的氨基酸序列起到切割β-芳基醚的作用。
7.一种分离的重组多肽，其包含：
长度范围为大约279至大约281个氨基酸；
由以下部分构成的第一氨基酸区域：得自SEQ ID NO：101的残基
19-54，或者除了SEQ ID NO：101的保守残基19-22，24，25，27-30，33-36，
39-45，47，48和50-54以外的保守性取代；以及
由以下部分构成的第二氨基酸区域：得自SEQ ID NO：101的残基
98-221，或SEQ ID NO：101的除保守残基100，101，104，111，112，115，116，
166，107，184，187，188，191，192和195以外的保守性取代。
8.一种分离的重组谷胱甘肽S转移酶，其包含：
长度范围为大约279至大约281个氨基酸；
第一氨基酸区域，其具有与得自SEQ ID NO：101残基19-54具有至少
95％的一致性，同时保留了SEQ ID NO：101的残基19-22，24，25，27-30，

\t33-36，39-45，47，48和50-54；其中所述的第一氨基酸区域定位于大约残基
14至大约残基59的重组多肽中；以及
第二氨基酸区域，其具有与得自SEQ ID NO：101残基98-221具有至少
95％的一致性，同时保留了SEQ ID NO：101的残基100，101，104，111，112，
115，116，166，107，184，187，188，191，192和195；其中所述的第二氨基酸
区域可以定位于大约残基93至大约残基226的重组多肽中；以及
其中所述的重组谷胱甘肽S转移酶可以起到切割β-芳基醚的作用。
9.权利要求8所述的分离的重组多肽，其中除了所述的保守残基以外
的氨基酸取代为保守性取代。
10.一种切割β-芳基醚键的方法，其包括：
将包含氨基酸序列的多肽与木质素衍生的化合物相接触，其中所述的
氨基酸序列与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性，并且所述的氨基
酸序列保留了SEQ ID NO：101的残基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，
48，50-54；100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，
192和195；所述的木质素衍生的化合物具有(i)β-芳基醚键，并且(ii)
分子量范围为大约180道尔顿至大约3000道尔顿；
其中所述的接触是在其中所述的木质素衍生的化合物是可溶的溶剂环
境中进行。
11.权利要求10所述的方法，其中所述的木质素衍生的化合物的分子
量为大约180道尔顿至大约1000道尔顿。
12.权利要求10所述的方法，其中除了所述的保守残基以外的氨基酸
取代为保守性取代。
13.权利要求10所述的方法，其中所述的溶剂环境包含水。
14.权利要求10所述的方法，其中所述的溶剂环境包含极性有机溶剂。
15.一种切割β-芳基醚键的方法，其包括：
将包含氨基酸序列的多肽与木质素衍生的化合物相接触，其中所述的
氨基酸序列与SEQ ID NO：101具有至少95％的一致性，并且所述的氨基
酸序列保留了SEQ ID NO：101的残基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，
48，50-54；100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，187，188，191，
192和195；所述的木质素衍生的化合物具有(i)β-芳基醚键，并且(ii)
分子量范围为大约180道尔顿至大约3000道尔顿；
其中所述的接触是在其中所述的木质素衍生的化合物是可溶的溶剂环
境中进行。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的木质素衍生的化合物的分子
量为大约180道尔顿至大约1000道尔顿。
17.权利要求15所述的方法，其中所述的溶剂环境包含水。
18.权利要求15所述的方法，其中所述的溶剂环境包含极性有机溶剂。
19.一种用于生物加工木质素衍生的化合物的系统，其包括：
具有氨基酸序列的多肽，其中所述的氨基酸序列与SEQ ID NO：101具
有至少95％的一致性，并且所述的氨基酸序列保留了SEQ ID NO：101的
残基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54；100，101，104，111，
112，115，116，166，107，184，187，188，191，192和195；
木质素衍生的化合物，其具有β-芳基醚键，并且分子量范围为大约180
道尔顿至大约3000道尔顿；以及
所述的木质素衍生的化合物可溶于其中的溶剂；
其中所述的系统通过将所述的多肽与所述的木质素衍生的化合物在所
述的溶剂中相接触来起到切割所述的β-芳基醚键的作用。
20.权利要求19所述的系统，其中除了所述的保守残基以外的氨基酸
取代为保守性取代。
21.一种包含核苷酸序列的重组多核苷酸，其中所述的核苷酸序列编
码了多肽，该多肽具有与SEQ ID NO：101至少95％的一致性的氨基酸序
列，并且该氨基酸序列保留的SEQ ID NO：101的残基19-22，24，25，27-30，
33-36，39-45，47，48，50-54；100，101，104，111，112，115，116，166，107，184，
187，188，191，192和195。
22.一种包含核苷酸序列的重组多核苷酸，其中所述的核苷酸序列编
码了多肽，该多肽包含SEQ ID NO：101；或者除了SEQ ID NO：101的保守
残基19-22，24，25，27-30，33-36，39-45，47，48，50-54；100，101，104，111，
112，115，116，166，107，184，187，188，191，192和195以外的保守性取代。
23.一种包含权利要求21所述的多核苷酸的载体。
24.一种包含权利要求22所述的多核苷酸的载体。
25.一种包含权利要求21所述的多核苷酸的质粒。
26.一种包含权利要求22所述的多核苷酸的质粒。
27.一种由权利要求23所述的载体所转化的宿主细胞。
28.一种由权利要求24所述的载体所转化的宿主细胞。
29.一种切割β-芳基醚键的方法，其包括：
在适于生产所述的多肽的条件下培养权利要求27所述的宿主细胞；
由所述的宿主细胞培养物回收所述的多肽；以及
将所述的多肽与木质素衍生的化合物相接触，其中所述的木质素衍生
的化合物具有(i)β-芳基醚键；并且(ii)分子量范围为大约180道尔顿
至大约3000道尔顿；
其中所述的接触是在其中所述的木质素衍生的化合物是可溶的溶剂环
境中进行。
30.权利要求29所述的方法，其中所述的宿主细胞为大肠杆菌。
31.权利要求29所述的方法，其中所述的宿主细胞为棕色固氮菌。
32.权利要求29所述的方法，其中所述的木质素衍生的化合物的分子
量为大约180道尔顿至大约1000道尔顿。
33.权利要求29所述的方法，其中除了所述的保守残基以外的氨基酸
取代为保守性取代。
34.权利要求29所述的方法，其中所述的溶剂环境包含水。
35.权利要求29所述的方法，其中所述的溶剂环境包含极性有机溶剂。
36.一种切割β-芳基醚键的方法，其包括：
在适于生产所述的多肽的条件下培养权利要求28所述的宿主细胞；
由所述的宿主细胞培养物回收所述的多肽；以及
将所述的多肽与木质素衍生的化合物相接触，其中所述的木质素衍生
的化合物具有(i)β-芳基醚键；并且(ii)分子量范围为大约180道尔顿
至大约3000道尔顿；
其中所述的接触是在其中所述的木质素衍生的化合物是可溶的溶剂环
境中进行。
37.权利要求36所述的方法，其中所述的宿主细胞为大肠杆菌。
38.权利要求36所述的方法，其中所述的宿主细胞为棕色固氮菌。
39.权利要求36所述的方法，其中所述的木质素衍生的化合物的分子
量为大约180道尔顿至大约1000道尔顿。
40.权利要求36所述的方法，其中所述的溶剂环境包含水。
41.权利要求36所述的方法，其中所述的溶剂环境包含极性有机溶剂。
42.一种用于生物加工木质素衍生的化合物的系统，其包括：
权利要求27所述的转化的宿主细胞；
木质素衍生的化合物，其具有β-芳基醚键；并且分子量范围为大约180
道尔顿至大约3000道尔顿；以及
所述的木质素衍生的化合物可溶于其中的溶剂；
其中所述的系统通过将所述的多肽与所述的木质素衍生的化合物在所
述的溶剂中相接触来起到切割所述的β-芳基醚键的作用。
43.权利要求42所述的系统，其中所述的转化的宿主细胞包括棕色固
氮菌。
44.权利要求42所述的系统，其中所述的转化的宿主细胞在其中所述
的木质素衍生的化合物是可溶的溶剂中表达所述的多肽。
45.一种用于生物加工木质素衍生的化合物的系统，其包括：
转化子，其包含使用权利要求23所述的载体转化的宿主细胞，该转化
子表达所述的多肽；
木质素衍生的化合物，其具有β-芳基醚键；并且分子量范围为大约180
道尔顿至大约3000道尔顿；以及
所述的木质素衍生的化合物可溶于其中的溶剂；
其中所述的系统通过将所述的多肽与所述的木质素衍生的化合物在所
述的溶剂中相接触来起到切割所述的β-芳基醚键的作用。
46.权利要求45所述的系统，其中所述的转化子包括大肠杆菌。
47.权利要求45所述的系统，其中所述的转化子包括棕色固氮菌。
48.权利要求45所述的系统，其中除了所述的保守残基以外的氨基酸
取代为保守性取代。
49.权利要求45所述的系统，其中所述的转化的宿主细胞在其中所述
的木质素衍生的化合物是可溶的溶剂中表达所述的多肽。
50.权利要求45所述的系统，其中所述的木质素衍生的化合物的分子
量为大约180道尔顿至大约1000道尔顿。
51.权利要求45所述的系统，其中所述的溶剂环境包含水。
52.权利要求45所述的方法，其中所述的溶剂环境包含极性有机溶剂。
53.一种用于生物加工木质素衍生的化合物的系统，其包括：
转化子，其包含使用权利要求24所述的载体转化的宿主细胞，该转化
子表达所述的多肽；
木质素衍生的化合物，其具有β-芳基醚键；并且分子量范围为大约180
道尔顿至大约3000道尔顿；以及
所述的木质素衍生的化合物可溶于其中的溶剂；
其中所述的系统通过将所述的多肽与所述的木质素衍生的化合物在所
述的溶剂中相接触来起到切割所述的β-芳基醚键的作用。
54.权利要求53所述的系统，其中所述的转化子包括大肠杆菌。
55.权利要求53所述的系统，其中所述的转化子包括棕色固氮菌。
56.权利要求53所述的系统，其中所述的转化的宿主细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：R·查特吉，K·赞恩，K·米歇尔，G·Y·刘，
申请(专利权)人：阿利吉那科技有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US