一种新型纯化PE类重组毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种新型纯化PE类重组毒素的方法，属生物蛋白快速纯化检验领域，以切胶纯化的绿脓杆菌外毒素重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体，筛选可在温和条件下进行抗原识别、洗脱的抗体，建立一种快速高效且不影响绿脓杆菌外毒素类重组毒素活性的亲和层析纯化方法。本发明专利技术的抗体亲和纯化方法，大大减少了操作步骤，节约了纯化时间。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属生物蛋白快速纯化检验领域。
技术介绍
绿脓杆菌外毒素PE为全长613个氨基酸的单链蛋白，可分为三个功能区:1a区(l-252aa)为细胞结合区，II区(253_364aa)负责毒素的跨膜转运，III区(400_613aa)包含ADP核糖基化功能及eEF2失活功能区；Ib区(365_399aa)处于II区与III区之间，含有一个二硫键，功能未知。PE杀细胞机制包括如下步骤:C末端的Lys613残基被胞浆或培养液中的羧肽酶去除，露出REDL (Arg-Glu-Asp-Leu)末端；Ia区结合到动物细胞表面的α -巨球蛋白受体上，内化后经由内涵体到达高尔基体；Furin蛋白酶将II区内的Arg279与Gly280氨基酸残基间的肽键切断；连接两个片段的Cys253与Cys364间的二硫键断裂；REDL结合胞内的KDEL受体,将37kDa的羧基端大片段从高尔基体转运到内质网(ER), lipid sorting to theER may occur ;280_313aa介导毒素转运至细胞质；III区内的ADP-核糖基化酶功能区灭活eEF2，ADP核糖基化涉及到His440和Glu本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种新型纯化PE类重组毒素的方法，表达PE类重组蛋白的重组菌经诱导后，菌体经超声破碎、离心取上清，加入终饱和度为50%的硫酸铵离心；其特征在于还包括如下方法：沉淀由50mM?Tris、600mM?NaCl、pH7.9溶液重悬后过抗体亲和层析柱；50mM?Tris、600mM?NaCl、pH7.9溶液继续冲洗5倍柱体积后，40%丙二醇、850mM?NaCl、50mM?Tris、pH7.9洗脱液洗剂，收集洗脱峰，PBS透析后进行SDS?PAGE分析得到高纯度的PE类重组毒素；所述抗体亲和层析柱所制备过程如下：（1）抗PE毒素的醇洗脱性抗体的制备；（2）亲和层析介质制备：制备螯合缓冲液，0.1M?N...

【技术特征摘要】
1.一种新型纯化PE类重组毒素的方法，表达PE类重组蛋白的重组菌经诱导后，菌体经超声破碎、离心取上清，加入终饱和度为50%的硫酸铵离心； 其特征在于还包括如下方法: 沉淀由50mM Tris>600mM NaCl、pH7.9溶液重悬后过抗体亲和层析柱；50mM Tris、600mM NaCl、pH7.9 溶液继续冲洗 5 倍柱体积后，40% 丙二醇、850mM NaCl、50mM Tris、pH7.9洗脱液洗剂，收集洗脱峰，PBS透析后进行SDS-PAGE分析得到高纯度的PE类重组毒素； 所述抗体亲和层析柱所制备过程如下: (1)抗PE毒素的醇洗脱性抗体的制备； (2)亲和层析介质制备: 制备螯合缓冲液，0.1M NaHC03、0.5M NaCl pH7，置于冰浴中备用；用等体积4°C的ImMHCl浸泡CNBr actived Sepha...

【专利技术属性】
技术研发人员：柳增善，宋杰，任洪林，卢士英，李岩松，周玉，张茂林，高世奇，吴南玄，
申请(专利权)人：吉林大学，
类型：发明
国别省市：