去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法及试剂盒技术

本发明专利技术者建立了一种去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法：包括单独应用ＰＭＸＢ，或联用ＰＭＸＢ和ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４，加有机溶剂混合后进行分相；或先应用ＰＭＸＢ和ＴｒｉｔｏｎＸ－１１４加有机溶剂进行分相，再与ＰＭＸＢ凝胶混合法和／或ＰＭＸＢ凝胶层析法相结合的方法去除质粒或蛋白质中的内毒素。本发明专利技术操作简便快速、成本低，可将质粒液或蛋白液中的内毒素量降低至１０ＥＵ／ｍｇ以下，符合临床用药标准，而且不影响去除内毒素后质粒或蛋白液的浓度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物医药领域，具体涉及基因疫苗、基因治疗所用质粒的纯化工艺及蛋白质的纯化工艺，更具体说，涉及去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法。
技术介绍
采用“裸工程质粒”的核酸疫苗是近十年出现的、目前正在研发的最新一代或第三代疫苗，研究显示其对第一、第二代疫苗基本无效的传染病如龋病、艾滋病、结核病、疟疾等的预防和乙型肝炎的治疗具有独特的优势和应用前景。核酸疫苗诱导机体细胞免疫应答能力的独特优点弥补了第一、第二代疫苗的不足，而且这些显著优点正是防治上述疾病所必须的，对此国际上已获得共识。另外，肿瘤的免疫治疗也主要依赖细胞免疫力，其核酸疫苗的研制也是当今热点之一。除了作为核酸疫苗外，质粒也可用于基因治疗和(表达)抗体治疗。因而质粒纯化技术的研究目前已从实验室阶段向实用产业化阶段发展。质粒是大肠杆菌细胞内能独立于染色体进行复制和表达的环形DNA。工程质粒是将大肠杆菌质粒经基因工程改造，在其中插入了编码病原体的保护性抗原蛋白的基因，和优选的免疫增强性细胞因子。将纯化的工程质粒注射入人体肌肉等部位，能在相关抗原加工处理细胞(Antigen Present Cell，APC)或肌肉细胞中表达所编码的抗原，诱导机体产生体液和细胞免疫应答反应来抵御病原体。目前研制的针对不同人类病原体的精心制备的工程质粒，基本上都采用美国FDA推荐的可用于人体的卡那霉素抗性大肠杆菌质粒pVAX1改造而成，其中除病原体基因和细胞因子不同外，整个结构大同小异。从培养的工程大肠杆菌中抽提质粒首先要破裂细菌使质粒释放出来，但是在释放质粒的同时还释放出大量大肠杆菌自身的RNA、基因组DNA、细菌蛋白质、脂类、细胞壁成分和内毒素等杂质，而质粒只占其中的千分之一左右，因此需要采用适当的技术提取质粒去除杂质。大规模破裂细菌的方法有机械和化学方法，而目前多采用化学方法即碱裂解法，其质粒破坏少回收率高(见卢圣栋主编“现代分子生物学实验技术”，第二版，中国协和医科大学出版社，1999年12月，北京；和J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔著，黄培堂等译“分子克隆实验指南”，第三版，2002年8月，科学出版社出版，北京，中有关章节)。本专利技术者在2004年12月21日提交的专利技术专利申请“改进的碱裂解法提取基本纯质粒的方法及多层层析装置”(申请号20041093322.1)已就初纯质粒制备过程中的牛胰腺RNA酶替代物、离子交换层析和浓缩生产工艺进行了实用性改进，获得了优良结果，但初纯质粒中所含高度污染的内毒素必须去除才能适合人体应用。另外，利用基因工程技术生产各种细胞因子、生长因子、白细胞介素、干扰素、激素、抗体等蛋白质已有二、三十年，其中不少采用大肠杆菌作为宿主菌，或利用噬菌体加宿主菌生产，因而也存在内毒素污染问题。但由于内毒素与蛋白质性质相差较大，蛋白污染的内毒素不多，含量为数千至数万EU/mg，而这些蛋白生产工艺中采用的沉淀、多步凝胶层析、亲和层析、超滤等多个步骤已足够逐渐去除内毒素，故一般不需再次去除内毒素。然而实验室小量制备蛋白时，有时需要去除其中的内毒素，以利于细胞培养、动物实验等用途。内毒素是热源物质，注入动物体内可引起动物发热等毒性作用，并大大降低质粒转化及细胞表达抗原的效率。内毒素(endotoxin)是革兰阴性菌(GNB)细胞壁外膜上的特有结构，其本质是脂多糖(LPS)。在化学结构上主要由两大部分组成，即多糖(polysaccharide)和类脂A(lipid A)，多糖又可分为0-特异性多糖链(0-spcificpolysaccharide chain)和核心寡聚糖(core oligosaccharide)两部分，结构见附附图说明图1，图1中A为光滑型LPS结构，由三部分组成，0-特异性侧链(m)、核心(外核+内核)(II)和类脂A(I)；B为粗糙型LPS结构，由两部分组成，核心(外核+内核)(II)和类脂A(I)。不同的革兰氏阴性细菌，其LPS的化学组成又有一定的差别，但都含有类脂A部分。类脂A是LPS的活性中心，也是其毒性的基础，主要由氨基葡萄糖、磷酸10、18碳的长脂肪酸组成，在生理条件下，具有疏水性和电负性。鲎试剂和内毒素的反应主要是与脂质A结合。内毒素在高温、强酸、强碱下都颇稳定。对于可用于人体的质粒，要求极高，即每毫克质粒中内毒素含量小于100EU，甚至小于10EU。由于不同核酸疫苗的质粒结构大同小异，又同样采用大肠杆菌作为工程菌进行培育增殖，其生产和提纯方法也基本相同，这与蛋白质疫苗的制备和纯化条件各异不同相比，具有很大的优点，即建立的提取纯化方法将具有通用性。传统的去除内毒素的方法有加热、蒸馏、过滤、反相渗透、活性碳粉、各种柱层析方法，这些方法能去除或灭活部分内毒素，但都很难将内毒素一次性彻底去除，甚至经过多个步骤后，最终仍达不到临床试验级的要求。目前通常采用的去除生物制品中内毒素的方法有TritonX-114雾点法和层析法。其中，雾点法可用于去除蛋白及质粒中污染的内毒素(Clement Bordier，JBiological Chemistry，2561604-07，1981；Aida Y&Pabst MJ，J Immunol Methods，132191-195，1990；Cotten M，Baker A，Sallik M等Gene Therapy，1239-46，1994)，然而这些文献披露的方法在操作过程中需要转换温度，操作难于控制，且它们均未报导可去除内毒素至何种水平。本专利技术者经实验后发觉此法只能将内毒素降至10万EU/mg(质粒)左右。一些公司开发的质粒纯化试剂盒采用了有机溶剂离心分相法代替上述雾点温度转换分相离心法，即利用Triton X-114的两性性能，采用能溶解TritonX-114(及其与内毒素形成的复合物)但与水混合时不能互溶的有机溶剂，经离心分相去除Triton X-114与内毒素形成的复合物的方法。其内毒素去除率略高，能使质粒中内毒素残余量降低至1000EU/mg左右，但所得质粒的浓度下降一倍以上，需要浓缩，而且所得超螺旋质粒的含量明显减少，变成二聚体、三聚体，这是人用生物制品所不允许的。本专利技术者应用Qiagen提供的质粒超纯试剂盒进行实验，发现内毒素也只能去除到1000EU/mg左右。因此这类试剂盒采用的方法仍难达到临床用核酸疫苗内毒素含量小于100EU/mg的标准。层析法可分为非特异性层析法和亲和层析法。非特异性层析法虽然能去除质粒中的内毒素达到临床级要求，但步骤较多，需要购买专用的填料和设备，生产成本高，同时因步骤过多导致质粒回收得率降低，这类方法不是专门去除内毒素的方法。亲和层析法是采用对内毒素有选择性结合能力的多粘菌素B(Polymyxin B，PMXB)亲和凝胶填料使内毒素结合在凝胶上，此法可去除蛋白制品中的内毒素，且PMXB凝胶用后可用1％脱氧胆酸钠再生而重复使用。然而，此PMXB凝胶填料用于去除质粒中内毒素的效果不是令人非常满意而应用不多。多粘菌素B硫酸盐，是一种从杆状多粘细菌的发酵产物中分离出来的阳离子环状多肽抗生素，其分子式为C55H96N16O13，其结构式见附图2，可见也具有两性(亲水性和亲脂性)基团。多粘菌素B是B1和B2突变体的混合物(其中本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用ＰＭＸＢ去除初纯质粒或蛋白质中内毒素的方法，包括以下步骤：将质粒或蛋白质与ＰＭＸＢ，按质粒与ＰＭＸＢ的重量比为１０００∶１００－８００或蛋白质与ＰＭＸＢ的重量比为１０００∶２．５－３０，于室温下混合均匀形成混合液；加入有机溶剂混匀后分层，收集含质粒或蛋白质的水相。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘庆良，
申请(专利权)人：上海海规生物科技有限公司，刘庆良，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]