应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法，涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶技术领域。本发明专利技术采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，在发酵过程中分别通过热处理培养物、在发酵培养基中添加甲醇或NaCl，实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标，并添加保护剂制成低温喷雾干燥或冷冻干燥干粉。本发明专利技术得到的酶经纯化后热稳定性和pH稳定性均高于吸水链霉菌合成的谷氨酰胺转氨酶，在食品加工、纺织行业和组织支架制备行业中具有很大的潜力。所用添加剂价格低廉，实施方法简便，可显著提高谷氨酰胺转氨酶产量，产量分别提高60%，160%和140%。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及链霉菌发酵生产谷氨酰胺转氨酶
，具体涉及一种采用应激条件提高发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的方法。
技术介绍
谷氨酸胺转氨酶(Transglutaminase,简称TGase, EC 2.3.2.13, R-glutaminyl-peptide:amnie- Y -glutamyl-transferase)又名转谷氨酰胺酶,它通过催化蛋白质中的谷氨酸残基上的甲酰胺与赖氨酸残基上的ε -氨基进行酰基转移反应，使蛋白质在分子内或分子间形成交联。·在二十世纪八十年代，Ikura等人报道了谷氨酰胺转氨酶对食物蛋白质的交联作用。他们用哺乳动物源谷氨酰胺转氨酶交联几种食物蛋白质，如酪蛋白、大豆蛋白等。这些蛋白的交联，提高了其产品的功能性，如凝胶性、溶解性和乳化性等。然而，由于其高昂的价格和低效的利用率限制了它在食品工业上的应用。从链霉菌中成功分离到微生物源谷氨酰胺转氨酶是促进其在食品工业上应用的一个里程碑。它使得这种酶可以大规模地生产，并且被商业利用。由于链霉菌谷氨酰胺转氨酶底物的催化特性，以及它在食品、纺织和医药行业中的广阔应用前景，受到了国内外学者的广泛关注，在亚洲的日本、台湾，欧洲的丹麦、荷兰、法国、德国、爱尔兰以及巴西等国家均投入了大量的人力、物力、财力进行研究，并取得了突飞猛进的进展。谷氨酰胺转氨酶的来源主要有3种:一是从动物的组织或体液中提取，例如牛、猪或鱼等，由于动物组织种类有限、来源稀少、含量低、组织特异性又极高，而且分离精制过程复杂，价格十分昂贵；在欧洲，商业化的凝血因子XIII (谷氨酰胺转氨酶的一种)主要通过宰杀牛或猪等动物来获得，但由于血液中的谷氨酰胺转氨酶通常需要凝血酶激活才具有活性，故很少应用于食品工业中。二是以大肠杆菌、棒状杆菌和链霉菌等为宿主，用基因工程手段来生产此酶。基因工程菌表达效果较差，远不能达到原有水平；虽然有些报道产量较高，但某些国家对基因工程产品限制比较严格。三是直接筛选产谷氨酰胺转氨酶的微生物，通过发酵法来生产。由于此方法技术可行、成本较低、生产不受出发材料和季节限制，最有可能进行大规模生产和广泛应用。但是目前食品级谷氨酰胺转氨酶来源单一、产量较低、价格昂贵，限制了其在食品工业上的应用。国内外提高微生物谷氨酰胺转氨酶产量的报导大多集中在优化发酵条件，改善培养基组成等方面。虽然这些研究都取得了一些成果，但是此酶的产量仍然较低。目前商业化的产品主要由日本味之素等公司生产。国内用微生物发酵法生产谷氨酰胺转氨酶尚处于起步阶段，产量较低。
技术实现思路
针对现有谷氨酰胺转氨酶的制备方法存在的问题，本专利技术提供一种。本专利技术的专利技术目的是通过如下技术方案实现的: 采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，在发酵过程中分别通过热处理培养物、在发酵培养基中添加甲醇或NaCl，发酵96h，最终实现了提高谷氨酰胺转氨酶产量的目标。具体技术方案如下: 1、菌种及发酵培养液: (I)菌种: 茂原链霉菌印iOffiiFce1S mobaraense) DSM40587:购于日本 NBRC。(2)斜面培养基(g/L):高氏一号培养基。(3)种子培养基(g/L):聚蛋白胨20，可溶性淀粉20，磷酸氢二钾2，磷酸二氢钾2，酵母粉2，无水硫酸镁2，pH 7.0。(4)初始发酵培养基(kg/1000L):聚蛋白胨30，可溶性淀粉10，果糖10，磷酸氢二钾2，酵母粉2，无水硫酸镁1，pH 7.0。 2、谷氨酰胺转氨酶酶活的测定方法: 采用分光光度法37 1:下测定。吸取5(^1^发酵液，加入0.51^试剂4，371:水浴保温IOmin,加入0.5mL试剂B，终止反应，500nm比色。试剂A:1OOmg 的 N-CBZ-Gln-Gly 溶解于 2mL、0.2mol/L 的 NaOH，依次加入 0.2mol/L、pH 6.0的Tris-HCl缓冲液4mL，0.lmol/L的羟胺2mL，0.01mol/L的还原型谷胱甘肽2mL，并调节pH至6.0。试剂B:3mol/L盐酸、12%三氯乙酸、5%FeCl3.6H20 (溶解于0.lmol/L的盐酸)按1:1:1的比例混合。I单位谷氨酰胺转氨酶活性(U)定义为:37°C，pH 6.0的条件下反应，每分钟产生浓度为Iymol的单羟肟酸所需的酶量。3、培养方法: 用5mL无菌生理盐水将培养7d的斜面孢子洗下，接种于IOOmL种子培养基中，30°C、200r/min培养48h后，按10%的接种量添加到发酵培养基中，30°C、200 r/min采用提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式培养，将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液，添加载体保护剂充分混溶，或这些保护剂与无细胞酶液充分混合再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除菌。采用低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉。4、上述提高谷氨酰胺转氨酶产量的培养方式如下: (I)热处理提高酶产量的培养方式: 将发酵48 h茂原链霉菌发酵液，快速加热至60-65 V，保持Imin后，将温度快速冷却到30°C,200 r/min条件下培养至96h,得到的谷氨酰胺转氨酶酶活1.16U/mL,显著地高于不加热对照组0.71U/mL,为对照样品的1.6倍。(2)甲醇胁迫提高酶产量的培养方式: 发酵起始时加入培养基重量的1%_3%甲醇，在30°C、200 r/min条件下培养96h后酶活达1.77U/mL，显著地高于以未加入甲醇的发酵培养物对照组0.67U/mL。(3) NaCl胁迫提高酶产量的培养方式:在发酵起始时向培养基中添加0.15-0.25 mol/LNaCl，在30°C、200 r/min条件下培养96h酶活力为3.0U/mL，显著地高于以未添加NaCl的发酵培养物对照组(1.25U/mL)，为对照组的2.4倍。5、载体保护剂添加: 上述所涉及的保护剂为以无细胞的酶液计蔗糖1_2%，海藻糖3-5%，甘油3-6%，经IOO0CU小时烘干，无菌条件下混料机充分混合；或这些保护剂与无细胞酶液充分混溶再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤除菌。6、低温喷雾干燥或冷冻干燥制成干粉: 将载体添加保护剂后，采用低温喷雾干燥方法干燥，条件为进风温度80°C，出风温度55- 60°C。或者采用真空冷冻干燥机干燥，冻干机冷井温度为_60°C，真空度为0.05MPa。本专利技术采用应激条件促进茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶，本法得到的酶经纯化后热稳定性和PH稳定性均高于吸水链霉菌合成的谷氨酰胺转氨酶，它在食品加工、纺织行业和组织支架制备行业中具有很大的潜力。所用的添加剂价格低廉，实施方法方便，可显著提高谷氨酰胺转氨酶产量，在其它培养条件相同的情况下，本专利技术比不改变培养条件的对照例产量分别提高60%、160%和140%，达到发酵法制备谷氨酰胺转氨酶的先进水平。具体实施例方式具体实施方式一:在发酵48h后,将发酵培养物置于水浴60_65°C加热Imin,继续发酵96h时得到的酶活1.16U/mL。将培养好的发酵液经板框过滤器过滤或压滤，再经0.22 μ m滤膜的微过滤装置过滤，制成无细胞的酶液。载体保护剂蔗糖1-2%本文档来自技高网...
【技术保护点】
应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法，采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，其特征在于在发酵过程中分别通过热处理培养基、在发酵培养基中添加醇类或NaCl，发酵96h提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶的产量。
【技术特征摘要】
1.应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法，采用茂原链霉菌为发酵菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中经液体发酵制备谷氨酰胺转氨酶，其特征在于在发酵过程中分别通过热处理培养基、在发酵培养基中添加醇类或NaCl，发酵96h提高链霉菌谷氨酰胺转氨酶的产量。2.根据权利要求1所述的应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述热处理培养基的方法为将发酵48h的培养物加热到60-65°C，处理0.5-1.5min，继续发酵至96h。3.根据权利要求1所述的应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于在发酵起始时加入培养基重量比的1-3%甲醇或在发酵起始时添加0.15-0.25mol/L NaCl,发酵至 96h。4.根据权利要求1、2或3所述的应激条件提高茂原链霉菌生产谷氨酰胺转氨酶产量的方法，其特征在于所述方法具体步骤如下:用5 mL无菌生理盐水将培养7 d的斜面孢子洗下，接种于100 mL种子培养基中，30 0C, 200 r/min培养48 h后，按10%的接种量添加到发酵培养基中，30°C、200r/min采用提高谷氨酰胺转氨酶...
【专利技术属性】
技术研发人员：张兰威，张莉丽，易华西，单毓娟，冯镇，杜明，韩雪，张英春，李洪波，焦月华，
申请(专利权)人：哈尔滨工业大学，
类型：发明
国别省市：
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