一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶及其检测抗生素的方法。本发明专利技术公开了一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶，在氨基糖苷类腺苷修饰酶的自由巯基Cys198上，标记有含有或修饰巯基的荧光基团，标记含有或者修饰巯基的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。本发明专利技术还公开了一种用上述荧光标记的氨基糖苷类修饰酶检测抗生素的方法，本发明专利技术制得的荧光标记的修饰酶试剂配制简单，成本低，酶催化反应快速、灵敏，因此可以方便、快捷、高效的检测食品、环境中残留的抗生素药物，不局限于实验室操作。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及，主要用于食品安全、医疗卫生和环境监测等领域的抗生素药物残留的检测和定量分析。
技术介绍
自1940年青霉素发现以来，数以千计的抗生素被开发用以传染性疾病的临床治疗，挽救了无数人的生命。但是随着抗生素广泛而大量地使用，许多细菌已经对它的对手产生了耐药性，很多药物不再像以前那样有效，甚至产生毒副作用。2010年8月11日，世界著名医学期刊《柳叶刀》刊文报道，带有一种特殊基因NDM-1 (新德里一号金属酶)的肠杆菌科细菌，对绝大多数常用抗生素耐药[Kumarasamy K K, et al., The Lancet InfectiousDiseases, 2010， 9， 597—602， French G L， International Journal of AntimicrobialAgents, 2010，36，S3-S7]。该报道立即引起广泛关注，媒体称之为“超级细菌”。随着全球感染人数的不断增加，引起人们对其全球蔓延趋势的担忧甚至恐慌。其实耐药型的细菌并非新事物，它们一直存在并且随着人类滥用抗生素而进化出强大耐药性，在这场特殊博弈中，人类是超级细菌的幕后推手。抗生素的滥用是一个全球性的问题，特别是中国已成为世界上滥用抗生素最为严重的国家之一。据2006-2007年度卫生部全国细菌耐药监测结果显示，全国医院抗菌药物年使用率高达74%。而在美英等发达国家，医院的抗生素使用率仅为22% 25%。中国的住院患者中，抗生素的使用率则高达70%，其中外科患者几乎人人都用抗生素，比例高达97%。我国每年因药物不良反应死亡20万人，其中因滥用抗生素死亡人数就达8万人[Andreas H, et al., The Lancet, 2009, 373, 30]。除了医疗卫生，动植物养殖，食品以及水质、环境中抗生素的滥用也日益严重，其影响不容小觑，特别是动物源性食品中抗生素严重超标，长期食用有抗食品，可在体内积累，抗生素的负作用会使身体器官受损，破坏体内的正常菌群，致使消费者的耐药性在不知不觉中增强，等于在人体内埋下“隐形炸弹”，将来一旦患病，很可能无药可医[Broughton E I, et al., Food Policy, 2010, 35,471-478]。瑞典传染病控制研究所的安德里亚斯.赫迪尼(Andreas Heddini)警告说,如果滥用抗生素的势头不能得到有效遏制，人类很可能重返前抗生素时代。世界卫生组织已成立了慎用抗生素联盟，其成员包括90多个国家，各国采取严厉的手段限制使用抗生素。我国主管部门也加强了对抗生素使用的监管，例如，国家药监局规定在零售药店销售必须凭执业医师处方才能销售抗生素类处方药，对食品、水质环境中抗生素类药品所占的比例限定标准；加强药物、食品中抗生素的检测。这些措施在促进抗生素合理使用方面发挥了一定的作用。目前食品、环境中常 用的抗生素检测方法为高效液相色谱、串联质谱方法，这些方法比较标准，具有分离能力强和较高的灵敏度，但是都要用到大型昂贵仪器，如色谱仪、质谱仪，且耗时长，技术流程较为复杂，需要专业人员操作，对现场检测，初选来说，很不现实[Holzgrabe U, et al., Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2011,56，271-279]。还有较快速的方法，如酶联免疫法以及微生物检测法，对实验条件要求也比较高，且试剂易受污染，准确度和专属性不高，时间性强等特点，也不理想[Makvand1-NejadS，et al., Journal of Immunological Methods, 2010, 360, 103-118]。因此，一种实时快速、便捷灵敏的抗生素检测方法和便携设备亟待开发，这对于食品安全、环境卫生监管等尤为迫切，将在遏制抗生素滥用方面发挥重要的作用。氨基糖苷类腺苷修饰酶(ANT (4’ ))是细菌产生的一种钝化酶，共价修饰抗生素的某些特定基团，干扰抗生素和核糖体的结合，从而使抗生素失去药效。它修饰的底物具有广谱性，多达数十种，是一个很好的模型蛋白[Revuelta J, et al.J.AM.CHEM.S0C.2008，130，5086 - 5103，WuCH, et al.J.Phys.Chem.B, 2012，116，5644 - 5652]。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中的不足，提出。使其用于氨基糖苷类抗生素的检测和定量分析；该检测方法具有检测速度快，操作便捷，灵敏度高的特点，可以满足食品、水质和环境中残留抗生素检测工作的要求。为了实现上述目的，本专利技术的技术方案为:一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶:在氨基糖苷类腺苷修饰酶的自由巯基Cysl98上，标记有含有或修饰巯基的荧光基团。所述标记含有或者修饰巯基的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺(Fluorescein-5-maleimide),其结构如图 2 所不。一种荧光标记的氨基糖苷类修饰酶检测抗生素的方法，该方法包括如下步骤: (I)将含有或者修饰巯基的荧光基团标记在氨基糖苷类腺苷修饰酶的自由巯基CyS198上； (2 )制备反应体系:将步骤(I)制得的标记有荧光基团的氨基糖苷类腺苷修饰酶与ATP溶液和二价金属离子溶液配置成混合溶液，混合溶液为中性，30°C水浴，备用；本步骤中，通过荧光检测装置检测荧光信号强度，使用标记荧光基团的特征激发光源和发射波段，如荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺，其中激发光源为494nm，检测波长为515nm ； (3)将一系列不同浓度的已知氨基糖苷类抗生素样品分别加入步骤(2)制得的反应体系，根据产生的荧光信号强度不同，制定抗生素浓度和荧光强度的标准曲线； (4)将含有氨基糖苷类抗生素的待测样本溶液加入步骤(2)制得的反应体系中，记录荧光信号的变化； (5)将步骤(4)得到的荧光信号和步骤(3)得到的标准曲线对比，判断待测样品中氨基糖苷类抗生素的残留以及定量分析。步骤(I)中所述含有或者修饰巯基的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺(Fluorescein-5-maleimide)ο所述混合溶液中标记荧光基团的氨基糖苷类腺苷修饰酶的浓度为0.l-ΙΟμΜ，二价金属离子的浓度为7.5mM, ATP的浓度为2.5mM。所述步骤(4)中待测样本溶液中的含有氨基糖苷类抗生素的浓度为 μΜ-ΙπιΜ。所述二价金属离子为Mg2+、Zn2+、Ca2+或Mn2+。在步骤(3)中，抗生素浓度与荧光强度的标准曲线建立:本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶，其特征在于：在氨基糖苷类腺苷修饰酶的自由巯基Cys198上，标记有含有或修饰巯基的荧光基团。
【技术特征摘要】
1.一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶，其特征在于:在氨基糖苷类腺苷修饰酶的自由疏基Cysl98上，标记有含有或修饰疏基的突光基团。2.根据权利要求1所述一种荧光标记的氨基糖苷类腺苷修饰酶，其特征在于:所述标记含有或者修饰巯基的荧光基团为荧光素-5-马来酰亚胺。3.一种荧光标记的氨基糖苷类修饰酶检测抗生素的方法，其特征在于该方法包括如下步骤: (I)将含有或者修饰巯基的荧光基团标记在氨基糖苷类腺苷修饰酶的自由巯基Cysl98上； (2 )制备反应体系:将步骤(I)制得的标记有荧光基团的氨基糖苷类腺苷修饰酶与ATP溶液和二价金属离子溶液配置成混合溶液，混合溶液为中性，30°C水浴，备用； (3)将一系列不同浓度的已知氨基糖苷类抗生素样品分别加入步骤(2)制得的反应体系，根据产生的荧光信号强度不同，制定抗生素浓度和荧光强度的标准曲线； (4)将含有氨基糖苷类抗生素的待测样本溶液加入步骤(2)制得的反应体系中，记录荧光信号的变化； (5)将步骤(4)得到的荧光信号和...
【专利技术属性】
技术研发人员：武灵芝，胡栋，
申请(专利权)人：南京邮电大学，
类型：发明
国别省市：
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