本发明专利技术涉及能够由DNA核苷酸聚合物模板产生非DNA核苷酸聚合物的核酸聚合酶，所述聚合酶包含与SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列具有至少36%同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列在相对于SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列在拇指区的一个或多个残基具有突变，所述残基选自氨基酸651至679(补丁10A)，其中所述氨基酸序列相对于SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列在残基E664具有突变。在一种实施方式中，所述聚合酶包含突变Y409G和E664K。在一种实施方式中，所述聚合酶包含对应于SEQ?ID?NO:12的氨基酸序列。本发明专利技术还涉及能够将HNA核苷酸聚合物逆转录为DNA核苷酸聚合物的核酸聚合酶，所述聚合酶包含与SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列具有至少36%同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ?ID?NO:1的氨基酸序列在残基I521具有突变。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】酶
技术介绍
生命多祥性很大程度上基于两种聚合物的多能性:多肽(即蛋白质)和多核苷酸(核酸)。生物系统的信息储存和传递通常基于两种核酸，即DNA和RNA。特别地，核酸表现出超出其编码遗传信息的独特性质，这使得它们成为化学、生物技术、纳米技术以及医药的重要工具。核酸还具有作为治疗剂的巨大潜能，但受到DNA和RNA化学性质(例如血清/核酸酶稳定性差)的固有的系统性限制。系统化学研究已开始揭开使DNA和RNA能够充当生命遗传系统的分子基础的关键性化学和物理化学參数。核酸化学结构(包括非天然核碱基)的变化1_3已用于研究用于信息储存的分子决定因素。交替的骨架连接4和呋喃核糖同源物5’6的合成性探索已得以研究并掲示骨架和/或糖(或等同物)的化学组成对核酸性质、结构以及构象具有深远的影响。重要的是，仅小亚组的化学物质允许通过与DNA或RNA的有效配对而进行跨聚合物的信息传递:形成能够与现存的生物系统沟通的合成性遗传系统的先决条件。然而，仅交叉杂交实验不能最终确定给定的化学物质充当遗传系统的能力，这是因为杂交不一定保留信息内容。对于用于信息储存、传递以及演化的潜在遗传聚合物的潜能的更为完全的检查需要复制系统。原则上，人工聚合物可被化学合成并复制，但非酶促聚合物通常效率低下并具有错误倾向7，因此，尽管在使用专门化学物质的单核苷酸8或短寡聚物(五聚物)単元9的聚合中取得了显著的进步，但作为一般方法仍不具有吸引力。使用DNA或RNA聚合酶的酶促聚合具有潜在的效力，但由于天然聚合酶的严格底物特异性而受到限制。尽管在对聚合酶底物特异性1(1的决定因素的理解和对具有拓展底物谱的聚合酶的工程化11’12方面取得了显著的进步，但在用于合 成和/或作为逆转录模板时，大部分非天然核苷酸类似物仍为不合适进行完全取代的聚合酶底物。DNA和RNA不仅是生命遗传信息的储库，它们还是具有如下显著特性的独特聚合物:它们根据明确定义的规则结合，可组装成几何结构确定的不同纳米结构，可进化为结合配体并催化化学反应，以及可用作超分子支架(scaffold)以在空间上配置化学基团。适体是在某些临床背景中具有与抗体竞争潜能的基于结构化单链核酸的ー类具有前景的生物分子治疗剂。现已描述了针对大量靶标的广谱的基于RNA和基于DNA的适体，当前对于其中一些进行的临床试验突显了其潜能。然而，基于诸如RNA或DNA的天然核酸的试剂在用于临床试剂和治疗剂的大量所需特性(例如体内稳定性和/或生物利用性)方面具有缺陷。原则上，适体(在筛选后)可通过药物化学方法稳定化，该方法已经由哌加他尼钠(Macugen)证实，哌加他尼钠是第一个基于适体的药物，已被批准用于治疗黄斑变性。然而，筛选后的修饰可改变和/或减弱适体结构和靶相互作用，并可改变适体特异性，这是个问题。大量经修饰的核苷酸已用于SELEX以生成包含非天然化学结构的适体。这些修饰中的某些赋予所筛选的适体所需特性，例如，核酸酶抗性和稳定性増加，但还具有诸如增加毒性和与蛋白质的非特异性相互作用的缺陷。原则上，正交(S卩，缺乏与细胞系统(machinery)的相互作用/相互干扰)及所导致的毒性缺失，核酸酶抗性增加以及其他潜在的所需特性可源于使用更彻底工程化的核酸。然而，它们在适体领域中的应用需要设计和合成这样的核酸以及生成定制的聚合酶以用于其合成、复制以及进化。问题是，本领域中没有这样的试剂和聚合酶。出于增加正交性的考虑，已经构建了许多新的核酸结构。其中所存在的挑战是设计出与细胞遗传系统具有最小相互作用/相互干扰而同时保留与细胞遗传系统交流的能力的支架。显著的成就包括在扩展遗传字母表(信息正交性)和改变核酸酶结构或大小(立体正交性)方面进行的尝试。然而，在这些情况的各种情况中，仍存在细胞毒性和/或信息特异性的问题。针对化学正交核酸的不同方法包括修饰骨架但保持信息核酸碱基完整。使用其他戊糖(例如己糖或丁糖)替代常规的呋喃核糖实际上对于螺旋构象和双链体稳定性和形成具有显著影响。
技术实现思路
本领域已知某些正交核酸。这些基于正交核酸化学，以在结构上不同于天然存在的DNA或RNA。正交核酸的一个实例是基于己糖醇(HNA)的正交核酸。另ー个实例是基于环己烯基(CeNA)核苷酸的正交核酸。然而，迄今为止，这样的正交核酸仅能够在化学上产生。这意味着生成具有生物学上有用长度的聚合物要求极高并且昂贵。本专利技术提供了能够将正交核苷酸聚合为正交核酸聚合物的核酸聚合酶。本专利技术人已经制备和选出了具有正交聚合酶活性的各聚合酶个体。作为其研究结果，本专利技术人已经确定了聚合酶中决定针对正交核苷酸的聚合酶活性并允许对该活性进行操作的特定区域和补丁(patch)。本专利技术基于这些令人惊讶的发现。因此，一方面，本专利技术提供了能够由DNA核苷酸聚合物模板产生非DNA核苷酸聚合物的核酸聚合酶，所述聚 合酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少36%同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列在拇指区(thumb region)的ー个或多个残基具有突变，所述残基选自:氨基酸651至679(补丁 10A);其中所述氨基酸序列相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列在残基E664具有突变。合适地，所述非DNA核苷酸聚合物为RNA聚合物，所述氨基酸序列相对于SEQ IDNO:1的氨基酸序列在残基Y409具有突变。合适地，当非DNA核苷酸聚合物为RNA聚合物时，所述聚合酶包含突变Y409N或Y409G。合适地，当非DNA核苷酸聚合物是RNA聚合物吋，所述聚合酶包含突变E664K或E664Q。合适地，当非DNA核苷酸聚合物是RNA聚合物时，所述聚合酶包含突变Y409N和E664Q(TgoT Y409N E664Q;TNQ)。合适地，当非DNA核苷酸聚合物是RNA聚合物时，所述聚合酶包含突变Y409G和E664K(TgoTY409G E664K;TGK)。合适地，所述聚合酶包含突变Y409G和E664K。另ー方面，本专利技术涉及一种制备RNA核苷酸聚合物的方法，所述方法包括使DNA模板与上文所述核酸聚合酶接触和温育以进行聚合。另ー方面，本专利技术涉及上文所述核酸聚合酶，其中所述聚合酶能够由DNA核苷酸聚合物模板产生HNA核苷酸聚合物，所述聚合酶包含对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸651至679 (补丁 10A)的序列。合适地，所述聚合酶能够由DNA核苷酸聚合物模板产生HNA核苷酸聚合物，所述聚合酶包含对应于SEQ ID NO: 12的氨基酸序列。另ー方面，本专利技术涉及ー种制备HNA核苷酸聚合物的方法，所述方法包括使DNA模板与上文所述合适聚合酶接触和温育以进行聚合。另ー方面，本专利技术涉及能够将HNA核苷酸聚合物逆转录为DNA核苷酸聚合物的核酸聚合酶，所述聚合酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少36%同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在残基1521具有突变。合适地，所述聚合酶包含选自I521L、I521P以及I521H组成的组的突变。合适地，所述聚合酶包含突变I521L。合适地，所述聚合酶还包含突变A485L。合适地，所述聚合酶还包含突变V93Q。合适地，所述聚合酶还包含突变E141A和E143A本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2010.04.30 GB 1007384.9;2010.05.20 US 61/396,0081.一种能够由DNA核苷酸聚合物模板产生非DNA核苷酸聚合物的核酸聚合酶，所述聚合酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少36%同一性的氨基酸序列，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在拇指区的ー个或多个残基具有突变，所述残基选自氨基酸651至679(补丁 10A)，其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID N0:1的氨基酸序列在残基E664具有突变。2.根据权利要求1所述的核酸聚合酶，其中所述非DNA核苷酸聚合物是RNA聚合物；且其中所述氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列在残基Y409具有突变。3.根据权利要求2所述的核酸聚合酶，其中所述聚合酶包含突变Y409G和E664K。4.一种制备RNA核苷酸聚合物的方法,所述方法包括使DNA模板与权利要求2或3所述的核酸聚合酶接触并温育以进行聚合。5.根据权利要求1所述的核酸聚合酶，其中所述聚合酶能够以DNA核苷酸聚合物为模板产生HNA核苷酸聚合物，所 述聚合酶包含对应于SEQ IDNO: 12的氨基酸651至679 (补丁10A)的氨基酸序列。6.根据权利要求5所述的核酸聚合酶，其中所述聚合酶能够以DNA核苷酸聚合物为模板产生HNA核苷酸聚合物，所述聚合酶包含对应于SEQ IDNO: 12的氨基酸序列。7.一种制备HNA核苷酸聚合物的方法,所述方法包括使DNA模板与权利要求5或6所述的核酸聚合酶接触并温育以进行聚合。8.一种能够将HNA核苷酸聚合物逆转录为DN...
【专利技术属性】
技术研发人员：菲利浦·霍林格，克里斯托弗·科曾斯，维托尔·B·皮涅罗，
申请(专利权)人：医药研究委员会，
类型：
国别省市：
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