本发明专利技术涉及一株重组细粒棘球蚴Eg95基因的粗糙型布鲁氏菌的构建及其疫苗。本发明专利技术以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，以蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的细粒棘球蚴Eg95基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达型重组细粒棘球蚴Eg95基因的重组布鲁氏菌RA343‑Eg95株。该重组菌株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，能产生针对细粒棘球蚴Eg95抗体，从而实现对细粒棘球蚴病的免疫保护。用该重组苗株制备的疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和细粒棘球蚴病的双重免疫保护。
A Rough Brucella Strain Recombinant Eg95 Gene of Eechinococcus granulosus and Its Vaccine Production Method
【技术实现步骤摘要】
一株重组细粒棘球蚴Eg95基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法所属
本专利技术涉及一株细粒棘球蚴EG95基因的粗糙型布鲁氏菌及其疫苗生产方法，属于兽用生物制品领域。技术背景布鲁氏菌病(布病)是由布鲁氏菌(Brucella)引起的以流产和发热为特征的人兽共患病，严重地威胁着人和多种动物的生命健康。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。因此在布鲁氏菌流行的国家，消除布病一直是公共卫生计划中最重要的目标之一。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，对布病发生相对比较严重的中国，由于扑杀的成本高，疫苗预防成为本病主要控制手段。2007—2012年间，本实验室陆续从我国不同省份和地区牛、羊、犬和鹿等动物体内分离到牛种布鲁氏菌41株，羊种布鲁氏菌74株，犬种布鲁氏菌9株。研究过程中，我们初步发现了一株牛种布鲁氏菌分离株，其毒力介于强毒和疫苗毒之间，专利申请人已对其进行了全面的生化检定，并分别用小鼠和豚鼠测定了其毒力。结果发现其毒力介于强毒和弱毒之间，测定为中等毒力布鲁氏菌，命名为Abortus343。本专利技术对此分离株进行了诱导和驯化，筛选获得了稳定的粗糙型布鲁氏菌疫苗株，命名为RA343，并已取得相关专利(ZL201410240895.6)。目前该疫苗株已经完成了全部的实验室研发和临床试验，进入新兽药注册环节。细粒棘球蚴病(又称包虫病)是一种由细粒棘球绦虫(Echinococ-cusgranulosus)的幼虫引起的一种人兽共患寄生虫病，处于续绦期的幼虫寄生在人体肝脏、肺脏等器官。研发有效作用的疫苗成为预防和控制该病的有效手段之一。Eg95被认为是最有前景的疫苗候选抗原基因，它具有较好的保护性和免疫原性。
技术实现思路
本专利技术的目的以粗糙型牛种布鲁氏菌弱毒株RA343株为亲本株，利用蔗糖自杀质粒为载体，将含有特定启动子序列的细粒棘球蚴Eg95基因经密码子优化后无痕插入到了布鲁氏菌基因组中，成功构建了能够高效表达细粒棘球蚴Eg95基因的重组布鲁氏菌RA343-Eg95株。该重组疫苗株不仅保留了原始亲本株RA343的粗糙型特性，对布鲁氏菌病(布病)良好的免疫保护性，而且该重组菌免疫动物后，同时能产生针对棘球蚴Eg95的抗体，从而实现对细粒棘球蚴的免疫保护。该重组菌制备的疫苗，免疫动物后能同时实现对布病和细粒棘球蚴病的双重免疫保护。本专利技术技术方案1.一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布鲁氏菌病和细粒棘球蚴的双重免疫保护；其生产菌株是含有能够高效表达细粒棘球蚴Eg95基因的重组布鲁氏菌RA343-Eg95株(本专利技术简称重组菌RA343-Eg95株)；该菌株是通过将P3启动子与Eg95序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3-Eg95序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3-Eg95+，将细粒棘球蚴Eg95基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄和蔗糖双重筛选，筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovinebrucella)重组布鲁氏菌RA343-Eg95株，并已于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.17331。2.如本专利技术所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于其生产用重组布鲁氏菌RA343-Eg95株区别于其他细菌的特异性是采用一对分别针对布鲁氏菌基因组和细粒棘球蚴Eg95基因的特异性PCR引物(序列21，序列22)，扩增出大小为635bp的特异性片段(序列23)；Eg95基因的表达验证是通过实时荧光定量PCR(qPCR)的方式验证Eg95基因转录水平的表达；通过蛋白印记法(WesternBlot)验证Eg95基因在蛋白水平的表达；将重组菌免疫小鼠，监测小鼠体内Eg95抗体的表达情况。3.本专利技术所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗的生产方法是用胰蛋白胨大豆肉汤作为布鲁氏菌CGMCCNo.17331株的培养基；培养基灭菌后按培养基量的1％～2％接入布鲁氏菌CGMCCNo.17331株种子菌液，37℃，按常规方法发酵培养28～38h，加入兽用生物制品常用的冻干保护剂，充分混匀、分装疫苗瓶中后经冷冻真空干燥，即成为布鲁氏菌RA343-Eg95株活疫苗。4.本专利技术所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗其中的冻干保护剂，其配方为：PVP5～15g，BSA5～15g，海藻糖50～100g，甘露醇50g，硫脲10～15g，抗坏血酸2g，维生素C2g，199培养2g，磷酸氢二钾1.25g，磷酸二氢钾0.52g，溶于注射用水1000ml中。5.本专利技术所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗免疫效果是通过将疫苗免疫动物后，分别采用布鲁氏菌及细粒棘球蚴病进行攻毒保护试验进行评价。本专利技术有益效果1.布鲁氏菌病和细粒棘球蚴病(包虫病)目前已成为对我国羊养殖业危害最大的两个人畜共患病。本专利技术用布鲁氏菌疫苗RA343为载体，构建了能成功表达了细粒棘球蚴Eg95基因的新型疫苗株，巧妙解决了两种重要疾病(布鲁氏菌病和包虫病)的防控难题，实现了“一针防两病”的构想，减少了生产实践中的免疫成本和劳动力成本。2.目前就全球范围内，困扰布病免疫防控的关键技术难题是疫苗免疫产生的抗体(光滑型抗体)干扰了布病的临床诊断。而本专利技术巧妙采用粗糙型布鲁氏菌(RA343株)作为载体，疫苗免疫动物后产生的是粗糙型抗体，不干扰布病的临床诊断，从根本上改进了现有布病疫苗的弱点。3.本专利技术解决了当前细粒棘球蚴病疫苗效率不高的困境。由于细粒棘球蚴体外培养极为困难，直接使用细粒棘球蚴虫卵生产疫苗难以实现，由于细粒棘球蚴Eg95抗原具有较好的保护性和免疫原性，因此通过表达Eg95抗原作为细粒棘球蚴病疫苗被认为是一种有效的替代方法。目前我国就是用大肠杆菌表达的Eg95抗原作为细粒棘球蚴病疫苗。但实践发现，大肠杆菌表达的Eg95并不能提供对细粒棘球蚴感染的良好保护，这可能与细粒棘球蚴主要诱发宿主的细胞免疫反应有关，而体外表达的Eg95抗原诱导宿主产生相应的抗体，但并不能阻止细粒棘球蚴对宿主的感染。本专利技术由于采用布鲁氏菌RA343活疫苗株作为载体，在诱导产生针对Eg95抗体的同时，也有效诱导宿主产生强烈的细胞免疫反应，从而实现了细粒棘球蚴病的高效免疫保护。4.为了确保Eg95抗原稳定高效表达，本专利技术一方面采用无痕插入技术代替质粒介导，直接将Eg95基因插入到布鲁氏菌疫苗株RA343的基因组中，并通过传代验证了其稳定性，从而确保了外源基因不会因为在生产传代过程中被丢失。另一方面，专利技术实施过程中我们以布鲁氏菌易于翻译的密码子代替Eg95基因中稀有密码子，这种对密码子进行优化的方法促进了外源基因的高效表达。常规动物活疫苗一般情况下都需要在-20℃保藏和运输，本专利技术设计了4组不同耐热保护剂配方，并优化出其中的一种最优配方作为实际采用的冻干保护剂，使本专利技术可以在4℃长期保存，减少了储藏和运输成本。本专利技术涉及微生物资源信息本专利技术中涉及的微生物资源为牛种布本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布鲁氏菌病和细粒棘球蚴的双重免疫保护；其生产菌株是含有能够高效表达细粒棘球蚴Eg95基因的重组牛种布鲁氏菌RA343‑Eg95株(本专利技术简称重组菌RA343‑Eg95株)；该菌株是通过将P3启动子与Eg95序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3‑Eg95序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3‑Eg95
【技术特征摘要】
1.一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于该疫苗免疫动物后能同时实现对布鲁氏菌病和细粒棘球蚴的双重免疫保护；其生产菌株是含有能够高效表达细粒棘球蚴Eg95基因的重组牛种布鲁氏菌RA343-Eg95株(本发明简称重组菌RA343-Eg95株)；该菌株是通过将P3启动子与Eg95序列进行密码子优化，人工合成基因片段，并构建含有P3-Eg95序列及布鲁氏菌上下游同源臂的蔗糖自杀质粒载体pUC/P3-Eg95+，将细粒棘球蚴Eg95基因表达框部分无痕插入到布鲁氏菌基因组中，通过氨苄和蔗糖双重筛选，筛选出阳性克隆，并进行传代培养，通过PCR及测序鉴定其稳定性，获得牛种布鲁氏菌(Bovinebrucella)重组布鲁氏菌RA343-Eg95株，并已于2019年03月14日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为：CGMCCNo.17331。2.如权利要求1所述的一种重组布鲁氏菌活疫苗，其特征在于其生产用重组布鲁氏菌RA343-Eg95株区别于其他细菌的特异性是采用一对分别针对布鲁氏菌基因组和Eg95基因的特异性PCR引物(序列21，序列22)，扩增出大小为635bp的特异性片段(序列23)...
【专利技术属性】
技术研发人员：丁家波，朱良全，蒋卉，王芳，范学政，冯宇，秦玉明，彭小薇，许冠龙，李秋辰，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京,11
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