本发明专利技术公开了一种发酵合成α‑红没药醇的工程菌株及其构建方法，属于生物工程技术领域。本发明专利技术以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入将不同来源的BBS基因和不同来源的ispA基因进行不同组合的优化表达，再进行密码子优化、RBS优化、启动子优化等策略，实现了高效生物合成α‑红没药醇。本发明专利技术为微生物系统高效发酵制备(﹣)‑α‑红没药醇奠定了基础，适合于工业化生产应用。
An Engineering Strain for Fermentation of Alpha-Red Myrrh Alcohol and Its Construction Method
【技术实现步骤摘要】
一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法
本专利技术涉及一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株及其构建方法，属于生物工程
技术介绍
α-红没药醇，又称甜红没药醇、防风根醇，是自然界中存在较多的倍半萜化合物之一，有α-体和β-体两种结构。(﹣)-α-红没药醇主要存在于春黄菊精油中，含量达17％，其右旋体存在于胶杨精油以及某些苦槛蓝属和鼠尾草属的精油中。红没药醇具有降低皮肤炎症、抑菌抗刺激、活血止痛、愈合溃疡、溶解胆石等多种生物活性，因此它可以作为活性成分用于皮肤化妆品或抑制皮肤炎症，以保护和护理过敏性皮肤等，在医药行业中的用途较广。此外，红没药醇香气清淡愉快，也是一种稳定性较好的定香剂，在香料香精化妆品中的应用也日益受到重视。红没药醇作为次级代谢产物，天然产量有限，若采用直接提取方法获取，不仅产量少而且会危及生态和环境安全，甚至造成濒危植物消失。红没药醇有复杂手性化学结构，若采用化学方法则化学合成难度高，纯度低，生物活性差。因此，利用生物构工程菌实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值和广泛用途的红没药醇是一条最具有潜力的途径。然而，现有的报道中，通过构建基因工程菌生产红没药醇的方法，其效果并不理想。如GuiHwanHan等通过三个步骤来构建产红没药醇基因工程菌，(1)将德国洋甘菊(﹣)-α-红没药醇合成酶基因(MrBBS)引入大肠杆菌；(2)设计了外源性MVA途径以增加红没药醇前体库；(3)过表达ispA基因，该基因有效地提供(﹣)-α-红没药醇前体(FPP)。但该过程繁琐，需引入一整条外源途径，且产量仅为80mg/L。(HanGH,KimSK,YoonKS,etal.Fermentativeproductionanddirectextractionof(-)-α-bisabololinmetabolicallyengineeredEscherichiacoli[J].MicrobialCellFactories,2016,15(1):185.)。因此，提供一种高效生物合成红没药醇的方法，对于工业生产红没药醇具有重要的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株，是以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，同时表达了BBS基因和ispA基因，所述ispA基因的氨基酸序列如SEQIDNO.12-SEQIDNO.14任一所示，所述BBS基因的氨基酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示，或，表达了氨基酸序列如SEQIDNO.17-SEQIDNO.19任一所示的蛋白质。在本专利技术的一种实施方式中，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。在本专利技术的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。在本专利技术的一种实施方式中，所述ispA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.3任一所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述BBS基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。在本专利技术的一种实施方式中，所述工程菌株以pEBS为表达载体(构建方法见YangS,LiuQ,ZhangY,etal.ConstructionandCharacterizationofBroad-spectrumPromotersforSyntheticBiology.[J].AcsSyntheticBiology,2017,7(1):287-291.)。本专利技术的第二个目的是提供一种生产α-红没药醇的方法，应用了上述工程菌株进行发酵。在本专利技术的一种实施方式中，将工程菌株接种于LB培养基中，置于200-220rpm，35-38℃培养10-12h，然后按5-10％的接种量转接于发酵培养基中，添加20-25％(v/v)的正十二烷，然后置于200-220rpm，35-38℃培养。培养50-70h在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基组分为(g/L)：酵母粉2.5，蛋白胨5.0，Na2HPO46.78，KH2PO43.0，NaCl0.5，NH4Cl1.0，MgSO4·7H200.5，CaCl20.015，葡萄糖40；FeCl2·6H2O0.013.5；MnCl2·4H2O，0.001；ZnCl2，0.0017；CuCl2·2H2O，0.00043。本专利技术的第三个目的是提供上述工程菌在制备α-红没药醇或含α-红没药醇的产品中的应用。本专利技术的有益效果：本专利技术以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，以枯草芽孢杆菌、大肠杆菌与酿酒酵母的三穿梭质粒pEBS为表达载体，在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入将不同来源的BBS基因和不同来源的ispA基因进行不同组合的优化表达，再进行密码子优化、RBS优化、启动子优化等策略，实现了高效生物合成α-红没药醇。本专利技术能够使大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h本专利技术在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌引入将不同来源的BBS基因和不同来源的ispA基因进行不同组合的优化表达，再进行密码子优化、RBS优化、启动子优化等策略，实现了高效生物合成α-红没药醇。本专利技术能够使大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后α-红没药醇积累量高达3.37g/L，枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后α-红没药醇积累量高达4.15g/L，在工业上具有潜在而广泛的应用价值。附图说明图1为不同来源的BBS基因和不同来源的ispA基因不同组合优化表达的构建示意图。图2为异源表达不同来源BBS基因和ispA基因的大肠杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后α-红没药醇积累量。图3为异源表达不同来源BBS基因和ispA基因的枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后α-红没药醇积累量。图4为优化BBS基因和ispA基因启动子的大肠杆菌、枯草芽孢杆菌重组菌在摇瓶上培养60h后α-红没药醇积累量。具体实施方式一、实施例涉及的核苷酸序列信息(1)SEQIDNO.1序列信息为来源于Bacillussubtilissubsp.subtilisstr.168的ispA基因核苷酸序列；(2)SEQIDNO.2序列信息为来源于Escherichiacolistr.K-12substr.MG1655的ispA基因核苷酸序列；(3)SEQIDNO.3序列信息为来源于EnterococcusfaecalisV583的ispA基因核苷酸序列；(4)SEQIDNO.4序列信息为来源于StreptomycescitricolorSC2的BBS基因核苷酸序列；(5)SEQIDNO.5序列信息为来源于Matricariachamomillavar的BBS基因核苷酸序列；(6)SEQIDNO.6序列信息为组成型启动子Pbe(1)核苷酸序列；(7)SEQIDNO.7序列信息为组成型启动子Pbe(2)核苷酸序列；(8)SEQIDNO.8序列信息为组成型启动子Pbe(3)核苷酸序列(9)SEQIDNO.9序列信息为基因簇Pbe(1)-BBSmcispAbs核苷酸序列；(10)SEQIDNO.10序列信息为基因簇Pbe(2)-BBSmcispAbs核苷酸序列；(11)SEQIDNO.11序列信息为基因簇Pbe(3)-BBSmcispAbs核苷酸序列。二、表达系统的构本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种发酵合成α‑红没药醇的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，同时表达了BBS基因和ispA基因，所述ispA基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.12‑SEQ ID NO.14任一所示，所述BBS基因的氨基酸序列如SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示，或，表达了氨基酸序列如SEQ ID NO.17‑SEQ ID NO.19任一所示的蛋白质。
【技术特征摘要】
1.一种发酵合成α-红没药醇的工程菌株，其特征在于，以大肠杆菌或枯草芽孢杆菌为宿主，同时表达了BBS基因和ispA基因，所述ispA基因的氨基酸序列如SEQIDNO.12-SEQIDNO.14任一所示，所述BBS基因的氨基酸序列如SEQIDNO.15或SEQIDNO.16所示，或，表达了氨基酸序列如SEQIDNO.17-SEQIDNO.19任一所示的蛋白质。2.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述大肠杆菌包括大肠杆菌MG1655，大肠杆菌DH5α，大肠杆菌W3110或大肠杆菌BL21。3.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述枯草芽孢杆菌包括枯草芽孢杆菌168、枯草芽孢杆菌W600或枯草芽孢杆菌W800。4.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述ispA基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1-SEQIDNO.3任一所示。5.根据权利要求1所述的工程菌株，其特征在于，所述BBS基因的核苷酸序列如SEQIDNO.4或SEQIDNO.5所示。6.根据权利要求...
【专利技术属性】
技术研发人员：康振，陈坚，堵国成，韦朝宝，王丽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32
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