一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法技术

本发明专利技术提供了一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法，先通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5717基因，以获得糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，再将获得的相应糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株用于发酵生产红霉素；其中，SACE_5717基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明专利技术的优点在于：通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌中SACE_5717基因，能够获得红霉素高产菌株，用所得的菌株发酵生产红霉素，可以提高红霉素产量，为工业生产提高红霉素产量提供新的技术支持。

A Method of Increasing Erythromycin Yield by Saccharopolyspora SACE_5717 Gene

The present invention provides a method for increasing erythromycin production by using SACE_5717 gene of erythromycin-polyspora. First, SACE_5717 gene is inactivated in erythromyces-polyspora by genetic engineering to obtain erythromycin-producing strain of erythromycin-polyspora-sugar, and then the corresponding engineering strain of erythromycin-producing erythromycin-sugar-polyspora obtained is used for fermentation to produce erythromycin, in which the nucleus of SACE_5717 gene is inactivated. The nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.1 and the amino acid sequence encoded by the nucleotide sequence is shown as SEQ ID NO.2. The advantages of the present invention are: inactivating SACE_5717 gene in erythromycin polyspora by genetic engineering can obtain erythromycin-producing strains, fermenting erythromycin with the obtained strains can improve erythromycin production, and provide new technical support for industrial production to improve erythromycin production.

【技术实现步骤摘要】
一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法
本专利技术涉及一种提高发酵生产红霉素产量的方法，尤其涉及一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法。
技术介绍
放线菌是一类能产生次级代谢产物的重要微生物资源，与人类密切相关，目前应用广泛的抗生素中约75％是由放线菌产生。常见的万古霉素、红霉素、林可霉素、四环素等不同类型次级代谢产物都是由放线菌产生的。放线菌中的抗生素合成是受合成基因簇控制，而合成基因簇的转录普遍依赖于特异性调控蛋白或全局性调控蛋白的调控，通过对此调控蛋白的研究，并对调控蛋白基因进行修饰，以对次级代谢进行调控，改变抗生素的产量。传统高产工业菌株是通过随机物理或化学诱变获得，随机诱变技术不但具有不确定性，而且不能对育种进行理性指导。本专利技术目的就是通过基因工程途径定向改变基因来获得红霉素高产菌株，用于红霉素或中间产物的生产。糖多孢红霉菌是1952年从土壤中分离出的革兰氏阳性丝状放线菌，而红霉素A是其重要的大环内脂类次级代谢产物。目前，红霉素化学衍生物在医药领域具有很重要的应用价值，红霉素及其衍生物每年的世界销售额达到近百亿美元。据此，关于如何提高红霉素产量这一问题也逐渐引起越来越多科学家的关注。2003年，Rodriguez等报道红霉素高产主要原因是由于其调控基因，而不是合成基因，使得研究的重点转向了调控基因。2007年，Oliynyk等完成了糖多孢红霉菌基因组测序。到目前为止，关于糖多孢红霉菌调控基因的研究依然很少，仅仅只有bldD(SACE_2077)、SACE_7040、SACE_0012、SACE_5599、SACE_3986、SACE_3986和SACE_5388等调控基因的研究报道。原核生物的转录调控子可以分为LysR、AraC/XylS、TetR、LuxR、LacI、ArsR、IcIR、MerR、Lrp/AsnC、MarR、NtrC(EBP)、OmpR、DeoR、Coldshock、GntR和Crp等16个家族。Lrp/AsnC家族转录调控因子广泛存在于细菌和古细菌中，在结构上具有共同的特征，核心结构一般是由两个部分组成，N端结构域是由具有保守的螺旋-转角-螺旋(helix-turn-helix,HTH)结构组成，它能够与靶DNA特异性结合；C端结构域为配体结合结构域(也称调控氨基酸代谢结构域，RAMdomain)，具典型的αβ-三明治折叠结构，C端结构域还参与介导多聚体的形成。Lrp/AsnC家族的蛋白调控功能广泛，大多数都参与调控氨基酸代谢和小分子的转运。基于糖多孢红霉菌基因组序列推测，糖多孢红霉菌SACE_5717基因属于Lrp/AsnC家族，并且，经本申请实验室研究发现，糖多孢红霉菌SACE_5717基因是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。据此，目前急需一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法。本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法，先通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5717基因，以获得糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，再将获得的相应糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株用于发酵生产红霉素；其中，SACE_5717基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。作为本专利技术的优选方式之一，所述在糖多孢红霉菌中失活SACE_5717基因中失活SACE_5717基因的步骤中，采用的糖多孢红霉菌原始菌株具体为糖多孢红霉菌A226菌株。作为本专利技术的优选方式之一，所述糖多孢红霉菌A226菌株为目前已公开、且为公众所得的菌株，由安徽大学提供，并由安徽大学于本申请申请日以前送往中国药用微生物菌种保藏管理中心进行保藏与登记，保藏编号为CGMCC8279。作为本专利技术的优选方式之一，具体方法如下：以糖多孢红霉菌SACE_5717基因或其表达产物为出发点，在红霉素高产菌株缺失Lrp/AsnC家族转录调控基因SACE_5717，获得糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，用于发酵生产红霉素。作为本专利技术的优选方式之一，所述糖多孢红霉菌SACE_5717基因的基因产物用于负向调控红霉素生物合成。本专利技术相比现有技术的优点在于：本专利技术研究中筛选到了红霉素生物合成负调控基因SACE_5717，通过基因工程途径失活糖多孢红霉菌中SACE_5717基因，能够获得红霉素高产菌株，为工业生产提高红霉素发酵产量提供技术支持。其中，当于糖多孢红霉菌A226中敲除SACE_5717基因时，红霉素产量提高了27％；而在ΔSACE_5717失活突变株中回补SACE_5717基因时，红霉素产量则得到了恢复；由此表明，SACE_5717是一个参与红霉素生物合成的负调控因子。利用高产菌株WB作为出发菌株，失活SACE_5717基因，红霉素产量提高25％，说明失活SACE_5717基因提高红霉素产量的技术在工业高产菌株中同样适用。附图说明图1是实施例7中SACE_5717基因失活突变株ΔSACE_5717的构建过程示意图；图2是实施例7中失活突变株的PCR验证图(硫链丝菌肽抗性基因(tsr)替换了糖多孢红霉菌染色体上SACE_5717基因，SACE_5717基因(501bp)被tsr(1360bp)替换后长度变为1600bp；图中，M：5000bpDNAMarker)；图3是实施例7中突变体的红霉素产量分析图(具体为出发菌株A226、失活突变株ΔSACE_5717、失活回补菌株、过表达菌株A226/pIB139-5717及过表达空载对照菌株在R5培养基中30℃发酵6天产物HPLC分析)；图4是实施例7中突变体的生物量检测结果图(具体为出发菌株A226及失活突变株ΔSACE_5717发酵过程中菌体干重的分析)；图5是实施例7中ΔSACE_5717突变株和野生型A226菌株的孢子生长情况显示图(图中，1：A226菌株；2：ΔSACE_5717突变株；3：回复菌株ΔSACE_5717/pIB139-5717；4：影响糖多孢红霉菌形态分化菌株ΔbldD)；图6是实施例7中ΔSACE_5717与出发菌株A226中相关基因转录分析图(SACE_5717失活突变株中，红霉素生物合成酶基因eryAI(SACE_0721)和红霉素抗性基因ermE(SACE_0733)，邻近的赖氨酸转运蛋白基因SACE_5716转录水平有显著提高)；图7是实施例7中工业高产WB/ΔSACE_5717突变体的PCR鉴定图(SACE_5717基因(501bp)被tsr抗性基因(1360bp)替换后长度变为1600bp；M：5000bpDNAMarker)；图8是实施例7中高产菌株WB及失活突变株WB/ΔSACE_5717红霉素A产量的HPLC分析图。本专利技术使用的重要菌株来源说明：本专利技术使用的糖多孢红霉菌A226菌株为目前已公开、且为公众所得的菌株，由安徽大学提供，并由安徽大学于本申请申请日以前送往中国药用微生物菌种保藏管理中心进行保藏与登记，经鉴定表现为存活，保藏编号为CGMCC8279。本专利技术使用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法，其特征在于，先通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5717基因，以获得糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，再将获得的相应糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株用于发酵生产红霉素；其中，SACE_5717基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法，其特征在于，先通过基因工程途径在糖多孢红霉菌中失活SACE_5717基因，以获得糖多孢红霉菌红霉素高产菌株，再将获得的相应糖多孢红霉菌红霉素高产工程菌株用于发酵生产红霉素；其中，SACE_5717基因的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示，核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。2.根据权利要求1所述的通过糖多孢红霉菌SACE_5717基因提高红霉素产量的方法，其特征在于，所述在糖多孢红霉菌中失活SACE_5717基因中失活SACE_5717基因...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘静，张部昌，吴杭，汪焰胜，陈云富，
申请(专利权)人：安徽农业大学，安徽大学，
类型：发明
国别省市：安徽,34