刺糖多孢菌HBERC-25376及其培养、活性物质的分离方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种刺糖多孢菌HBERC-25376及其培养、活性物质的分离方法与应用。刺糖多孢菌菌种代号为HBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?No：M2013076。培养方法是菌种的准备、扩大或发酵、二级种子培养或发酵，调节发酵液pH4.5，板框过滤或离心，得到上清液和菌丝体两部分；用薄膜浓缩器浓缩上清液，或采用萃取法或树脂吸附法对上清液进行提取。发酵过程中产生束霉素A、结节霉素、椒疫霉素，它们具有良好的杀虫、杀菌（真菌、细菌）活性，可用于小菜蛾、棉铃虫等农作物害虫及辣椒疫霉等农作物真菌病害的防治。其活菌制剂也有用于生物防治的潜力。这几种抗生素毒性很低，部分可用于动物及人类疾病的防治。还可通过固体发酵或固-液两相发酵制成活菌制剂。

【技术实现步骤摘要】
刺糖多胞菌HBERC-25376及其培养、活性物质分离方法与应用
本专利技术涉及一种刺糖多胞菌HBERC-25376及其培养方法，活性物质的分离方法，及在农作物病虫害防治中的应用。
技术介绍
近年来，我国农药残留导致的食品安全问题非常突出，频频发生的农药中毒事件不断给全社会敲响了警钟。同时因大量高毒高残留化学农药的使用，导致我国农产品出口形势严峻，而且对土壤、水体、大气造成严重污染，破坏生态平衡。生物农药是绿色食品和有机农产品生产不可或缺的生产资料，对于保证农产品质量安全和生态环境安全，提高人民生活水平具有重要的积极意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述现状，旨在提供一种悬浮率高，喷药不堵塞喷头，可喷雾，也可颗粒剂穴施，防治效果好的刺糖多胞菌HBERC-25376及其培养方法，活性物质的分离方法与在农作物病虫害防治中的应用。本专利技术目的的实现方式为，刺糖多胞菌HBERC-25376，菌种代号为HBERC-25376，SaccharopolysporaspinosaHBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2013076。形态特征如下：菌落直径2-3mm，分散状；基丝无色，直径约0.6-0.8μm；气丝白色至灰白色，直径0.8-1.0μm，菌苔表面粉状；孢子丝直至弯曲形，每链含20-30个卵圆形孢子，孢子大小1.0×1.5μm。刺糖多胞菌HBERC-25376培养方法，具体步骤如下：（1）菌种的准备：将斜面菌种或甘油冻存管或冻干管中菌种孢子或菌丝，在严格无菌条件下，接种至装有100毫升种子培养基的500毫升带挡板三角瓶中，在25-30℃条件下，在摇床上100—350转/分培养3-6天，在严格无菌条件下，取样，染色，镜检；取菌种的斜面孢子在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在25-30℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到一定浓度后，按1：1加入事先准备好的体积比为40%的无菌甘油，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存，每次使用一支冻存管；种子培养基、发酵培养基配方：甘露醇1-3%，大豆蛋白胨1-3%、酵母浸粉0.3-0.5%、碳酸钙0.3-0.5%、氯化钠0.3-0.8%；pH值6.5-7.5，每瓶装100mL；（2）扩大或发酵：待种子瓶长好以后，按体积3—10%的接种量转入二级种子培养基或发酵培养基中；二级种子培养基或发酵培养基，发酵过程同第一级发酵；发酵过程需要5-7天，用HPLC检测，待产物达到较高产量时即可放罐；（3）发酵液预处理：在发酵完成后，用稀酸将发酵液pH调整到4-5，然后进行板框过滤或离心，得到上清液和菌丝体两部分；（4）上清液的处理：上清液处理方式有二：①用薄膜浓缩器在50-60℃，0.1-0.09MPa条件下浓缩3-8倍后，加入防腐剂、稳定剂、表面活性剂，制成液剂产品；所述防腐剂为：苯甲酸钠或山梨酸钾，所述稳定剂为：黄原胶或琼脂，所述表面活性剂为：吐温80或1231，防腐剂、稳定剂、表面活性剂统称助剂；②采用萃取法或树脂吸附法进行提取，萃取法，将等体积的乙酸乙酯与发酵上清液混合，充分搅拌1±0.2小时，上清液中的活性物质就会转移到溶剂中，分离出酯相，在减压下蒸干，即得目标活性物质提取物；所采用的减压浓缩条件为：真空度0.1-0.09MPa，温度40-60℃；树脂提取法，将大孔吸附树脂按说明书进行预处理，然后按2%-5%的比例加入上清液中，200-400转/分搅拌处理1-2小时，用40-100目筛网过滤，获得树脂，将收获的树脂用少量纯水冲洗，然后按1：10-20的比例（W/V）加入乙酸乙酯，置容器中100-300转/分搅拌30-120分钟，弃去树脂，将酯相分离出来，减压浓缩即可获得目标产物提取物；所采用的减浓缩条件为：真空度0.1-0.09MPa，温度40-60℃。刺糖多胞菌HBERC-25376活性物质的分离方法，刺糖多胞菌的活性物质有刺糖多胞菌HBERC-25376的活性物质束霉素(BundlinA)、结节霉素(Nodusmycin)、椒疫霉素(Capsimycin)，它们在同一菌种采用相同的培养基发酵时会同时产生；束霉素A的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在10-11分钟流出的组份即为束霉素A，其化学结构式为；ChemicalFormula:C25H33NO7ExactMass:459.23结节霉素的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在16-17分钟流出的组份即为结节霉素，其化学结构为；ChemicalFormula:C28H37NO8ExactMass:515.25椒疫霉素的分离方法：采用C18制备色谱柱，粒径5μm，色谱柱直径19mm，长250mm。进样时采用自动进样，每次进样量1000-5000μL，用乙腈和纯水为流动相，梯度洗脱，收集在20-21分钟流出的组份即为椒疫霉素，其化学结构式为ChemicalFormula:C30H40N2O6ExactMass:524.29MolecularWeight:524.65刺糖多胞菌HBERC-25376活性物质的应用，束霉素A用作制备小菜蛾、棉铃虫的防治，人和动物细菌性感染冶疗的制剂；结节霉素用作制备农作物细菌性病害防治，人和动物细菌性感染冶疗的制剂；椒疫霉素用作制作小菜蛾、棉铃虫防治，以及辣椒疫霉病防治的制剂。本专利技术的刺糖多胞菌具有良好的杀虫、杀菌（真菌、细菌）活性，可用于小菜蛾、棉铃虫等农作物害虫及辣椒疫霉等农作物真菌病害的防治；活菌制剂也有用于生物防治的潜力；活菌制剂毒性很低，部分也可用于动物及人类疾病的防治，如肠道传染病等。还可通过固体发酵或固-液两相发酵制成活菌制剂。附图说明图1是束霉素A的紫外吸收收光谱及质谱图，图2是结节霉素的紫外吸收收光谱及质谱图，图3是椒疫霉素的紫外吸收收光谱及质谱图，图4是HBERC-25376的发酵过程曲线图，图5是菌种表面特征，图6是菌种的进化树图，图7是HBERC-25376结节霉素的核磁共振氢谱图，图8是HBERC-25376结节霉素的二维核磁共振图，图9是HBERC-25376结节霉素的二维核磁共振碳谱图，图10是刺糖多胞菌HBERC-25376液剂在湖北省生物农药工程研究中心试验基地进行的防治小菜蛾的温室试验效果图。本专利技术的菌种为刺糖多胞菌HBERC-25376，菌种代号为HBERC-25376，SaccharopolysporaspinosaHBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，中国典型培养物保藏中心地址中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCCNo：M2013076，保藏日期2013年3月12日，存活证明日期2013年4月17日。具体实施方式本专利技术的刺糖多胞菌HBERC-25376，菌种代号为HBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2013076。刺糖多胞菌HBERC-253本文档来自技高网...

【技术保护点】
刺糖多孢菌HBERC?25376，其特征在于其菌种代号为HBERC?25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC?No：M2013076。

【技术特征摘要】
1.刺糖多胞菌HBERC-25376(SaccharopolysporaspinosaHBERC-25376)，其特征在于其菌种代号为HBERC-25376，保存在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNo：M2013076。2.根据权利要求1所述的刺糖多胞菌HBERC-25376，其特征在于形态特征如下：菌落直径2-3mm，分散状；基丝无色，直径0.6-0.8μm；气丝白色至灰白色，直径0.8-1.0μm，菌苔表面粉状；孢子丝直形和弯曲形，每链含20-30个卵圆形孢子，孢子大小1.0×1.5μm。3.根据权利要求1所述的刺糖多胞菌HBERC-25376，其特征在于在ISP-2号培养基上生长很好，在高氏一号培养基上生长尚可，均不产生水溶性色素。4.权利要求1所述的刺糖多胞菌HBERC-25376的培养方法，其特征在于具体步骤如下：(1)菌种的准备：将斜面菌种或甘油冻存管或冻干管中菌种孢子或菌丝，在严格无菌条件下，接种至装有100毫升种子培养基的500毫升带挡板三角瓶中，在25-30℃条件下，在摇床上100—350转/分培养3-6天，在严格无菌条件下，取样，染色，镜检；上述种子的培养过程即为第一级发酵，所用培养基配方即为第一级发酵培养基；所述甘油冻存管的制备方法如下：取菌种的斜面孢子在严格无菌操作条件下接入种子培养基中，在25-30℃，130-160转/分的旋转式摇床上培养3-4天，待菌丝长到一定浓度后，按1：1加入事先准备好的体积比为40％的无菌甘油溶液，混合均匀，分装至2毫升冻存管中，置-80℃保存，每次使用一支冻存管；第一级发酵培养基配方：甘露醇1-3％，大豆蛋白胨1-3％、酵母浸粉0.3-0.5％、碳酸钙0.3-0.5％、氯化钠0.3-0.8％；pH值6.5-7.5，每瓶装100mL；(2)扩大或发酵：待种子瓶长好以后，按体积3—10％的接种量转入二级种子培养基或发酵培养基中；二级种子培养或发酵培养的培养基、发酵温度和摇床转速同第一级发酵；发酵过程需要5-7天，用HPLC检测，待产物达到较高产量时即可放罐；(3)发酵液预处理：在发酵完成后，用稀酸将发酵液pH调整到4-5，然后进行板框过滤或离心，得到上清液和菌丝体两部分；(4)上清液的处理：上清液处理方式有二：①用薄膜浓缩器在50-60℃，0.1-0.09MPa条件下浓缩3-8倍后，加入防腐剂、稳定剂、表面活性剂，制成液剂产品；所述防腐剂为：苯甲酸钠或山梨酸钾，所述稳定剂为：黄原胶或琼脂，所述表面活性剂为：吐温80或1231，防腐剂、稳定剂、表面活性剂统称助剂；②采用萃取法或树脂吸附法进行提取，萃取法，将等体积的乙酸乙酯与发酵上清液混合，充分搅拌1±0.2小时，上清液中的活性物质就会转移到溶剂中，分离出酯相，在减压下蒸干，即得目标活性物质提取物；所采用的减压蒸干条件为：真空度0.1-0.09MPa，温度40-60℃；树脂提取法，将大孔吸附树脂按说明书...

【专利技术属性】
技术研发人员：万中义，杨自文，王开梅，江爱兵，方伟，张亚妮，张志刚，闵勇，曹春霞，刘晓艳，龙同，吴兆园，廖先清，刘芳，黄大野，朱志刚，
申请(专利权)人：湖北省生物农药工程研究中心，
类型：发明
国别省市：