一种植物植原体基因组的测序方法技术

本发明专利技术公开了一种植物植原体基因组的测序方法，其中，包含获取富含植原体的白花泡桐组织培养幼苗茎；白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物分离提取；白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物测序；植原体基因组测序数据的处理、统计和组装和对白花泡桐和植原体的转录组进行测序，验证基因组的可靠性。本发明专利技术首次得到了泡桐丛枝植原体的基因组，并通过该基因组对泡桐丛枝病原菌与寄主相互作用的信息进行了分析，该发明专利技术有助于增加了解植原体基本代谢途径信息，为全面揭示植物植原体基因组信息奠定基础。

A Sequencing Method for Plant Phytoplasma Genomes

The invention discloses a method for sequencing plant phytoplasma genome, which includes obtaining seedling stems of Paulownia Alba tissue culture rich in phytoplasma, isolation and extraction of DNA mixtures of Paulownia alba and phytoplasma genomes, sequencing of DNA mixtures of Paulownia alba and phytoplasma genomes, processing, statistics and assembly of phytoplasma genome sequencing data, and processing, statistics and assembly of phytoplasma genome sequencing data, and Paulownia alba and phytoplasma. The transcriptome was sequenced to verify the reliability of the genome. The invention obtains the genome of Paulownia Arbuscular phytoplasma for the first time, and analyses the information of interaction between Paulownia Arbuscular pathogen and host through the genome. The invention helps to increase the basic metabolic pathway information of phytoplasma, and lays a foundation for revealing the genome information of plant phytoplasma comprehensively.

【技术实现步骤摘要】
一种植物植原体基因组的测序方法
本专利技术涉及基因测序
，特别是涉及一种植物植原体基因组的测序方法。
技术介绍
植原体是一种特殊的多形性无细胞壁的细菌，寄生在植物的韧皮部筛管中，可以通过昆虫进行传播，引起世界范围内数百种植物发生病害，其中包括一些重要的经济作物，如小麦，玉米，花生等，造成巨大的经济损失。此外，许多由植原体引起的新疾病正在出现，因此，开展植原体基因组的研究是有必要的对于分析植原体的遗传进化和致病机理有重要意义。到目前为止，世界范围内在近400余种植原体中仅报道了用脉冲电泳等方法绘制的6种植原体完整的基因组序列：‘Ca.P.asteris’洋葱黄化植原体(OY-M)，翠菊黄化丛枝植原体(AY-WB)，玉米簇生植原体M3，‘Ca.P.mali’苹果簇生植原体(AT)，‘Ca.P.australiense’澳大利亚葡萄黄花植原体(PAa)和草莓致死黄花植原体(SLY)。此外，还绘制了16SrIII组中的X疾病植原体、花生丛枝植原体、‘Ca.P.pruni’植原体(CX)和16SrIII-J组的紫松果菊丛枝植原体的基因组草图的绘制工作。已有的基因组研究分析表明，植原体的基因组普遍较小，其范围为530至1,350kb，其DNA的G+C含量非常低，在23.0-29.5％范围内。此外，这些植原体之间存在相当大的差异，在已发表的完整基因组中最小的是AT，其基因组大小仅为602kb，且其染色体是线性组成的，而其他已发表的基因组是圆形的，AT和其它植原体之间存在显着差异。与植原体相关的质粒首先在玉米丛生植原体中报道。直到最近，已经报道了23种来自各种植原体菌株的质粒并进行了测序。来自不同植原体的这些质粒，不仅在数量上有很大差异，而且在大小上也有很大差异。而现有技术中还未对泡桐丛枝植原体以及它的遗传需求、基因组特征和进化关系有足够的了解。由于植原体不能在无细胞的人工培养基上培养，所以难以制备和纯化足够量的植原体DNA用于基因组测序，因此，植原体基因组学测序受到限制，因此植原体基因组的获取手段很大程度上取决于与其宿主DNA的分离技术。因此，提供一种植物植原体基因组的测序方法，对泡桐丛枝植原体进行测序，并对该病原菌与泡桐丛枝相互作用的信息进行了分析是本领域技术人员亟需解决的问题。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术首次得到了泡桐丛枝植原体的基因组，并通过泡桐丛枝植原体的基因组对该病原菌与泡桐相互作用的信息进行了分析，不仅有助于增加了解植原体基本代谢途径的信息，而且为更全面披露植物植原体大基因组奠定基础。为了实现上述目的，本专利技术采用如下技术方案：一种植物植原体基因组的测序方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)获取富含植原体的白花泡桐组织培养幼苗茎在培养基上培养含有植原体的泡桐丛枝幼苗，每天25-29℃、130μmol·m-2s-1光照，14-18小时周期条件下培养28-32天，后收获幼苗的嫩茎段,在液氮中冷冻后，储存在-80℃冰箱；(2)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物分离提取；采用CTAB法提取白花泡桐和植原体的混合基因组DNA，并在OD260/280和OD260/230的吸光度值下评估DNA样品的纯度，并检测DNA的完整性，最后纯化DNA样品，并将DNA保存在-80℃以备后用；(3)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物测序；用g-TUBE中断富含所述植原体的白花泡桐基因组DNA，并富集和纯化DNA片段，然后对片段化的DNA进行损伤修复和末端修复；采用连接酶将DNA片段两端与接头连接；未能连接的DNA片段用外切酶切除，然后对连接产物进行纯化，同时采用试剂盒对文库进行评估，最后将DNA模板和酶的混合物，进行实时单分子测序；(4)植原体基因组测序数据的处理、统计和组装；在测序数据中去除接头和低质量读长得到高质量读长，同时去除与寄主泡桐相似的读长；然后将高质量读长进行组装，先将长读长用作种子纠正短读长，其中大于8366bp的读长作为长读长，小于8366bp的读长作为短读长，再对用作种子的高质量读长进行组装；最后，将原始数据与组装的参考序列进行比对，并对组装后的结果进行优化和校正；进行测序深度分析，去掉覆盖深度低于100.00X的低深度重叠群，连接其余的重叠群；组装后,将原始数据与组装的参考序列比对，计算参考序列的覆盖深度和百分比；(5)对白花泡桐和植原体的转录组进行测序，验证基因组的可靠性。优选的，步骤(3)用1X磁珠富集和纯化DNA；优选的，步骤(4)中连接其余的重叠群，组装后，将原始数据与组装的参考序列比对以计算参考序列的每个可能的覆盖深度和百分比，故可以评估装配的完整性和排序的一致性；其中，本专利技术获得总碱基数为2,853,395,086bp，高质量读长295,269条，平均长度是9,663bp，N50读长长度为12,569bp；过滤掉白花泡桐基因组后，得到植原体的32,596条读长，总碱基数为272,697,220bp，读长的平均长度为8,336bp，N50读长的长度为11,497bp，最长读数为54,019bp。本专利技术通过对植原体基因组测序数据的处理、统计和组装可以评估装配的完整性和排序的一致性，并对白花泡桐和植源体的转录组进行测序，验证基因组的可靠性，本专利技术克服了由于细菌只能在细胞中培养，难以制备和纯化足够量的植原体DNA用于基因组测序，而使得大规模的植原体基因组测序工作受到了限制的技术障碍，本专利技术首次获得了泡桐丛枝(PaWB)植原体的基因组，为分析植源体遗传禀赋和致病机制提供了有力工具。进一步的，步骤(2)中，CTAB法提取泡桐丛枝和植原体的混合基因组DNA的方法为：将样品研磨成粉末，吸取65℃预热的CTAB1000μL加入含有0.1-0.2g研磨好的样品的离心管中，充分混合，再加入等体积的溶液混合物一充分混合后离心；吸出液体上清液再加入等体积的溶液混合物二，充分混匀后离心；再吸出液体上清液，加入1/10体积3mol/L的NaAc，pH5.2和2.5倍体积的无水乙醇轻轻搅拌均匀；离心后弃去液体上清液；加入70％乙醇，冲洗DNA沉淀物，然后离心弃去上清液；最后将DNA干燥后加入无菌双蒸水再加入RNAase，37℃，保持30分钟。进一步的，溶液混合物一为体积比分别为25：24：1的苯酚、氯仿和异戊醇混合物。进一步的，溶液混合物二为体积比分别为24：1的氯仿与异戊醇混合液。进一步的，步骤(4)中，对所述高质量种子读长组装的方法为：对所述高质量种子读长，采用OLCassemblyalgorithm软件进行组装。进一步的，步骤(4)中，所述低质量读长为除接头外，未知碱基比例大于10％的读长和质量值小于10的碱基数占整条读长的50％以上的读长。经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本专利技术提供了一种植物植原体基因组的测序方法，具有如下技术优点：本专利技术先采集了富含植原体的白花泡桐组织培养幼苗的嫩茎；并对白花泡桐和植原体的DNA混合物进行了测序，然后过滤掉与白花泡桐基因组一致的读长，以获得纯植原体序列；最后对白花泡桐和植原体的转录组进行测序，验证了基因组的可靠性。通过上述方法，克服了难以制备和纯化足够量的植原体DNA，用于基因组测序的技术障碍，获得了泡桐丛枝(PaWB)植原体的基因组，为分析植原体遗传禀赋和致病本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种植物植原体基因组的测序方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)获取富含植原体的白花泡桐组织培养幼苗茎在培养基上培养含有植原体的泡桐丛枝幼苗，每天25‑29℃、130μmol·m‑2s‑1光照，14‑18小时周期条件下培养28‑32天，后收获幼苗的嫩茎段,在液氮中冷冻后，储存在‑80℃冰箱；(2)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物分离提取；采用CTAB法提取白花泡桐和植原体的混合基因组DNA，并在OD260/280和OD260/230的吸光度值下评估DNA样品的纯度，并检测DNA的完整性，最后纯化DNA样品，并将DNA保存在‑80℃以备后用；(3)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物测序；用g‑TUBE中断富含所述植原体的白花泡桐基因组DNA，并富集和纯化DNA片段，然后对片段化的DNA进行损伤修复和末端修复；采用连接酶将DNA片段两端与接头连接；未能连接的DNA片段用外切酶切除，然后对连接产物进行纯化，同时对文库进行评估，最后将DNA模板和酶的混合物，进行实时单分子测序；(4)植原体基因组测序数据的处理、统计和组装；在测序数据中去除接头和低质量读长得到高质量读长，同时去除与寄主泡桐相似的读长；然后将高质量读长进行组装，先将长读长用作种子纠正短读长，其中大于8366bp的读长作为长读长，小于8366bp的读长作为短读长，再对用作种子的高质量读长进行组装；最后，将原始数据与组装的参考序列进行比对，并对组装后的结果进行优化和校正；进行测序深度分析，去掉覆盖深度低于100.00X的低深度重叠群，连接其余的重叠群；组装后,将原始数据与组装的参考序列比对，计算参考序列的覆盖深度和百分比；(5)对白花泡桐和植原体的转录组进行测序，验证基因组的可靠性。...

【技术特征摘要】
1.一种植物植原体基因组的测序方法，其特征在于，包含以下步骤：(1)获取富含植原体的白花泡桐组织培养幼苗茎在培养基上培养含有植原体的泡桐丛枝幼苗，每天25-29℃、130μmol·m-2s-1光照，14-18小时周期条件下培养28-32天，后收获幼苗的嫩茎段,在液氮中冷冻后，储存在-80℃冰箱；(2)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物分离提取；采用CTAB法提取白花泡桐和植原体的混合基因组DNA，并在OD260/280和OD260/230的吸光度值下评估DNA样品的纯度，并检测DNA的完整性，最后纯化DNA样品，并将DNA保存在-80℃以备后用；(3)白花泡桐和植原体基因组的DNA混合物测序；用g-TUBE中断富含所述植原体的白花泡桐基因组DNA，并富集和纯化DNA片段，然后对片段化的DNA进行损伤修复和末端修复；采用连接酶将DNA片段两端与接头连接；未能连接的DNA片段用外切酶切除，然后对连接产物进行纯化，同时对文库进行评估，最后将DNA模板和酶的混合物，进行实时单分子测序；(4)植原体基因组测序数据的处理、统计和组装；在测序数据中去除接头和低质量读长得到高质量读长，同时去除与寄主泡桐相似的读长；然后将高质量读长进行组装，先将长读长用作种子纠正短读长，其中大于8366bp的读长作为长读长，小于8366bp的读长作为短读长，再对用作种子的高质量读长进行组装；最后，将原始数据与组装的参考序列进行比对，并对组装后的结果进行优化和校正；进行测序深度分析，去掉覆盖深度低于100.00X的低深度重叠群，连接其余的重叠群；组装后,将原始数据与组装的...

【专利技术属性】
技术研发人员：范国强，翟晓巧，赵振利，曹喜兵，
申请(专利权)人：河南农业大学，
类型：发明
国别省市：河南,41