猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法及其应用技术

本发明专利技术公开了一种猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法及其应用，该方法将猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV‑YN144培养，过滤得到病毒滤液；向病毒滤液中碳酸氢钠溶液，在磁力搅拌条件下缓慢滴加壳聚糖溶液；再缓慢滴加三聚磷酸钠溶液；搅拌得到混合液；将明胶与混合液混匀，冷冻干燥即得到猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球。本发明专利技术所使用的包裹工艺过程不添加有机试剂，保留了抗原活性，制备过程简单、省时，且易于储存运输。本发明专利技术的猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球能增强疫苗的免疫效果，延长疫苗的作用时间。

Preparation and application of porcine epidemic diarrhea virus attenuated live vaccine chitosan microspheres

The invention discloses a method for preparing a porcine epidemic diarrhea virus attenuated live vaccine chitosan microsphere and its application. The method is to culturing the virus PEDV YN144 of porcine epidemic diarrhea virus and filtrate the virus filtrate, slowly adding chitosan solution to the sodium bicarbonate solution of the virus filtrate under the condition of magnetic stirring, slowly adding sodium tripolyphosphate solution, stirring and mixing. After mixing the gelatin with the mixed solution, the porcine epidemic diarrhea virus attenuated live vaccine chitosan microspheres were obtained by freeze drying. The packaging process used in the invention does not add organic reagents, retains antigenic activity, has simple preparation process, saves time, and is easy to store and transport. The live attenuated vaccine of porcine epidemic diarrhea virus can enhance the immune effect of the vaccine and prolong the time of action of the vaccine.

【技术实现步骤摘要】
猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法及其应用
本专利技术涉及生物医药领域，具体地指一种猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻(PED)是由猪流行性腹泻病毒(PEDV)引起的一种急性、高度传染性肠道疾病，新生仔猪的发病率和死亡率都接近100％，给养猪业造成巨大经济损失(Sunetal.,EID,2012)。其临床特征主要表现是仔猪呕吐、严重腹泻和脱水；PEDV感染猪，剖检病理变化主要表现为猪的空肠和回肠部分的肠绒毛的萎缩和脱落(PensaertandYeo,2006)。PED对猪的危害很大，各种年龄的猪均可发病，但对哺乳仔猪的危害最为严重，20日龄以内仔猪死亡率达95％以上(TimoneyJFetal.,1988)。目前，PED仍在世界范围内广泛流行。在欧洲各国，PED较以前的流行程度已明显降低，但是在亚洲猪场中PEDV的感染率非常高，尤其是在韩国、日本和中国等，PEDV与TGEV有相似的临床症状，致病机理也极为相似，但是PEDV的感染率明显高于TGEV和猪轮状病毒(PoRV)。PED的防控，主要是以疫苗免疫预防为主。目前，PED商业化的疫苗主要是灭活苗和弱毒苗两种，灭活疫苗具有安全、稳定的优点，但由于灭活疫苗具有需要大剂量接种或者应用浓缩抗原；免疫期短，常需强化接种；不能引起局部免疫，以致细胞免疫的作用弱；产生完全免疫力需要2周；不利于紧急预防接种与降低疫苗费用等缺点，使得PED弱毒疫苗成为了研究的热。目前，PED的商品化弱毒疫苗主要有我国的CV777株，日本的P-5V株和韩国的KPED-9株、DR13株。在中国，用来预防猪流行性腹泻的活疫苗毒株主要是CV777疫苗毒株，但2006年我国报道的PED疫苗免疫猪场不能提供完全的保护(ChenJFetal.,2010)，近期的研究也发现我国变异毒株占主导地位(GaoYetal.,2013)。2011年由猪流行性腹泻变异毒株引起的腹泻在CV777弱毒活疫苗免疫猪场暴发，表明传统CV777弱毒疫苗免疫已经不能有效地预防变异毒株所造成的腹泻，而当今变异毒株引起的PED在世界范围类肆掠，所以通过PEDV临床分离到的变异毒株开发安全、高效、廉价的变异毒株来源的PEDV弱毒疫苗是世界养猪业的迫切需要。PEDV主要在肠粘膜表面启动其感染周期，因此刺激肠道黏膜产生特异性sIgA，成为防制本病发生和研制PED疫苗关键的问题(BinLietaletal.,2017)。然而，现有的商业化灭活苗和弱毒苗在注射免疫后，只能诱导体液免疫应答，不能激活黏膜免疫系统，即使有较高的血清抗体滴度，仍不能阻止病原经黏膜入侵体内，因而免疫效果不佳。口服疫苗与注射疫苗相比，有着方便、应激少、能够激起黏膜免疫等诸多优势，而成为研究的热点(Mohammadetal,2012)。PED口服疫苗策略是使妊娠晚期母猪获得免疫，新生仔猪通过哺乳的方式，从乳汁中摄取sIgA从而获得被动免疫来抵御病毒入侵(StephanieN.Langeletaletal.,2016)。由于现有PED口服疫苗经过胃内的复杂环境后，效果有所下降。因此，急需一种新型PED疫苗的发展应当着力于加强妊娠母猪的粘膜免疫，提供持续的免疫刺激，从而使仔猪获得更有效和长久的免疫保护。
技术实现思路
本专利技术目的是针对现有技术的不足，提供了一种猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法及其应用。为实现上述目的，本专利技术提供的一种猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法，包括以下步骤：1)将猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-YN144培养，得到病毒液；然后离心过滤去除细胞碎片和其它杂质，得到病毒滤液，其中，病毒滤液中病毒含量大于等于106TCID50/ml，且小于等于108TCID50/ml；2)将壳聚糖加入体积浓度为1％～5％的乙酸溶液，超声溶解；即得到壳聚糖溶液；其中，壳聚糖溶液的浓度为0.5～5mg/1ml；3)按体积比3∶3～20∶0.060～0.070∶1～20量取壳聚糖溶液、病毒滤液、碳酸氢钠溶液和三聚磷酸钠溶液；其中，碳酸氢钠溶液的浓度为60～100mg/ml，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.3～2.0mg/ml；4)向病毒滤液中碳酸氢钠溶液，在磁力搅拌条件下缓慢滴加壳聚糖溶液；再缓慢滴加三聚磷酸钠溶液；在室温、转速为1000～1500rpm条件下磁力搅拌8～15min；得到混合液；5)按体积比1∶3～5将明胶与混合液混匀，冷冻干燥即得到猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球。进一步地，所述病毒滤液中，病毒含量为106TCID50/100ml。再进一步地，所述步骤2)中，壳聚糖溶液的浓度为3mg/ml，所述乙酸溶液体积浓度为3％。再进一步地，所述步骤3)中，壳聚糖溶液、病毒滤液、碳酸氢钠溶液和三聚磷酸钠溶液的体积比为：3∶15∶0.067∶1再进一步地，所述步骤3)中，碳酸氢钠溶液的浓度为96g/ml，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.5mg/ml。再进一步地，所述步骤4)中，转速为1200rpm条件下磁力搅拌10min.。再进一步地，所述猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的半径为500～1000nm。本专利技术还提供了一种上述制备的猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球在制备治疗预防猪流行性腹泻的疫苗中应用。本专利技术的原理：本专利技术所用的毒株是由本实验室在2013年8月分离到的变异PEDV毒株YN1(GenBankNO.：KT021227)，运用Vero细胞传代致弱PEDV的方法，获得的一种猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-YN144(GenBankNO.：KT021232)(ChenFZetal.,2015)，将分离到的变异猪流行性腹泻病毒在Vero细胞上连续传代120代，然后通过克隆纯化继续在Vero细胞上传代至144代，命名猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-YN144，2015年11年10日将该毒株送交位于湖北省武汉市武汉大学内的中国典型微生物保藏中心(CCTCC)保藏，其保藏编号为CCTCCNO:V201547，然后在10μg/mL胰酶的条件下在Vero细胞上连续传6代得到的YN150。从30代开始在ORF3基因433bp处有1个碱基的缺失，造成了ORF3蛋白的提前终止，S蛋白在144-145aa处有两个氨基酸的缺失，这些特点在60代，90代，120代，144代和150代毒株都稳定存在。致弱实验表明，从60代开始，变异PEDV对仔猪失去致病性；将PEDVYN150在猪体内连传5代，没有任何毒力返强现象。区域性的临床试验表明此毒株对变异毒株引起的PED的免疫原性和安全性都很好，对妊娠母猪、育肥猪和仔猪等各年龄猪均安全。免疫猪后产生抗体，对猪安全无害，对人和植物无害，对环境没有污染。利用壳聚糖易于形成微球的性质制备猪流行性腹泻减毒活疫苗壳聚糖微球，能够保护抗原免受胃酸和胃蛋白酶破坏，并能靶向黏膜表面，在黏膜表面缓慢释放包裹的抗原，增强疫苗的免疫效果和作用时间。壳聚糖是甲壳素(Chitin)经脱乙酰基后得到的一种天然的带正电的多糖。不溶于水，可溶于乙酸。由于其良好的生物安全性和生物相容性、与黏液层相互吸附、成本低等优点，从而成为口服疫苗载体的研究热点(Mohammadetal.,2012)。采用离本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV‑YN144培养，得到病毒液；然后离心过滤去除细胞碎片和其它杂质，得到病毒滤液，其中，病毒滤液中病毒含量大于等于106TCID50/ml，且小于等于108TCID50/ml；2)将壳聚糖加入体积浓度为1％～5％的乙酸溶液，超声溶解；即得到壳聚糖溶液；其中，壳聚糖溶液的浓度为0.5～5mg/ml；3)按体积比3∶3～20∶0.060～0.070∶1～20量取壳聚糖溶液、病毒滤液、碳酸氢钠溶液和三聚磷酸钠溶液；其中，碳酸氢钠溶液的浓度为60～100mg/ml，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.3～2.0mg/ml；4)向病毒滤液中碳酸氢钠溶液，在磁力搅拌条件下缓慢滴加壳聚糖溶液；再缓慢滴加三聚磷酸钠溶液；在室温、转速为1000～1500rpm条件下磁力搅拌8～15min；得到混合液；5)按体积比1∶3～5将明胶与混合液混匀，冷冻干燥即得到猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球。

【技术特征摘要】
1.一种猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1)将猪流行性腹泻病毒弱毒株PEDV-YN144培养，得到病毒液；然后离心过滤去除细胞碎片和其它杂质，得到病毒滤液，其中，病毒滤液中病毒含量大于等于106TCID50/ml，且小于等于108TCID50/ml；2)将壳聚糖加入体积浓度为1％～5％的乙酸溶液，超声溶解；即得到壳聚糖溶液；其中，壳聚糖溶液的浓度为0.5～5mg/ml；3)按体积比3∶3～20∶0.060～0.070∶1～20量取壳聚糖溶液、病毒滤液、碳酸氢钠溶液和三聚磷酸钠溶液；其中，碳酸氢钠溶液的浓度为60～100mg/ml，三聚磷酸钠溶液的浓度为0.3～2.0mg/ml；4)向病毒滤液中碳酸氢钠溶液，在磁力搅拌条件下缓慢滴加壳聚糖溶液；再缓慢滴加三聚磷酸钠溶液；在室温、转速为1000～1500rpm条件下磁力搅拌8～15min；得到混合液；5)按体积比1∶3～5将明胶与混合液混匀，冷冻干燥即得到猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球。2.根据权利要求1所述猪流行性腹泻病毒减毒活疫苗壳聚糖微球的制备方法，其特征在于：所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：何启盖，张程光，陈芳洲，吴美洲，范盛先，何东贤，李中华，孟宪荣，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42