一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法技术

本发明专利技术公开了一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法。该方法主要通过慢病毒构建稳定细胞系的方式，使得在NF‑κB反应元件或者IFN‑β启动子控制下的荧光素酶基因稳定表达在人上皮细胞A549细胞中，然后通过流式筛选得到单克隆，进一步筛选对LPS有反应的阳性克隆子，最后使用细菌内毒素标准品刺激并同时和鲎试剂进行比较，从而建立了一种新的使用上皮细胞系检测热原的方法。所述的上皮细胞系检测热原的方法不需要使用动物就能够真实地模拟人体对热原的反应，并且能够对的分布范围极为广泛的LPS有较强的反应，灵敏度高，稳定性好，而且A549细胞市售易得使该热原检测方法简单易行。

Preparation of a monoclonal cell line capable of detecting pyrogen

The invention discloses a method for preparing a monoclonal cell line capable of detecting pyrogenic elements. In this method, the luciferase gene was stably expressed in human epithelial cell line A549 under the control of NF_kappa B reaction element or IFN_beta promoter by constructing stable cell lines with lentiviruses. Then the monoclones were obtained by flow cytometry, and the positive clones were further screened for LPS. The bacterial endotoxin standard was stimulated and compared with tachypleus amebocyte lysate (TAL), so a new method for pyrogen detection using epithelial cell lines was established. The method for detecting pyrogen by epithelial cell line can truly simulate the reaction of human body to pyrogen without using animals, and has strong reaction to LPS with extremely wide distribution range, high sensitivity and good stability, and the method for detecting pyrogen by A549 cells is easy to be sold on the market.

【技术实现步骤摘要】
一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法
本专利技术属于生物
，涉及药品和生物制品(包括基因工程制品)中热原的检测
.
技术介绍
热原是一类在宿主体内可以引起发热和诱导炎症反应的异构类化合物。药品和医疗器械热原的污染是系统性炎症最常见的原因，甚至更糟糕的是会引起败血性休克(Palma,L.,etal.AssayDrugDevTechnol,2017.15(2):64-76.；Gimenes,I.,etal.RegulToxicolPharmacolm,2015.73(1):356-360.)。大多数为我们所知道的热原是微生物来源的，包括细菌，酵母，真菌，病毒和它们的组分以及环境颗粒(Daneshian,M.,etal.JImmunolMethods,2008.336(1):64-70.)。研究最好的是细菌细胞壁的组分，例如革兰氏阴性菌的脂多糖(LPS，也被称为内毒素)或者革兰氏阳性菌的脂磷壁酸(LTA)和肽聚糖(PGN)(Daneshian,M.,etal.JImmunolMethods,2008.336(1):64-70.；Stang,K.,etal.JMaterSciMaterMed,2014.25(4):1065-1075.)，这些热原物质会刺激宿主的白细胞去释放炎症细胞因子和导致严重的反应，如多器官衰竭，败血性休克甚至死亡(Stang,K.,etal.JMaterSciMaterMed,2014.25(4):1065-1075.；Hasiwa,N.,M.Daneshian,andT.Hartung,2013.30(2):169-209.)。因此，热原检测是一个医药产品的先决条件。目前，几种不同的检测热原方法可以被获得，分别是家兔热原检测法(RPT)，细菌内毒素检测法(BET，也被称为鲎试剂法(LAL))，和单核细胞检测法(MAT)(Stang,K.,etal.JMaterSciMaterMed,2014.25(4):1065-1075.)。家兔热原检测法(RPT)，一个黄金的热原检测标准，它是基于在静脉注射待检测的溶液或者移植医疗器械之后观察家兔温度的上升情况(Stang,K.,etal.JMaterSciMaterMed,2014.25(4):1065-1075.；Su,W.andX.Ding,2015.20(4):354-364.)。在二十世纪初，由于家兔对热原的灵敏度和人类的灵敏度是相似的(Vipond,C.,etal.,ALTEX,2016.33(1):47-53.)，因此，RPT被应用于检测不同类型的热原污染(Palma,L.,etal.AssayDrugDevTechnol,2017.15(2):64-76.)。然而，家兔的灵敏度容易受到很多因素影响，例如家兔的品系，年龄和性别以及饲养条件等(Stang,K.,etal.JMaterSciMaterMed,2014.25(4):1065-1075.)。而且，RPT是既昂贵又费时的。除此之外，家兔法仅仅是定性检测而不是定量的(Hasiwa,N.,M.Daneshian,andT.Hartung,2013.30(2):169-209.)。细菌内毒素检测法(BET)是一种可替代家兔的体外质量控制方法，它主要检测革兰氏阴性菌的内毒素，这是基于鲎变形细胞溶解产物所引起的凝胶酶联级联反应，并因此它也被称为鲎试剂检测法(Novitsky,T.J.,BiologyandConservationofHorseshoeCrabs,2009:315-329.)。和家兔法相比，LAL法可以对内毒素进行半定量或者定量检测，甚至是在飞克水平。然而，LAL的结果会被蛋白酶所影响。LAL也会对一些聚合形式的糖展现出反应活性，例如存在于真菌，藻类和酵母细胞内的3-葡聚糖。尽管β-(1,3)-D-葡聚糖不是热原性的物质，但是它可以诱导凝胶级联反应，然后干扰LAL对LPS的反应(Su,W.andX.Ding,2015.20(4):354-364.；Ding,J.L.andB.Ho,TRENDSinBiotechnology,2001.19(8):277-281.)。此外，这种检测方法对LPS的反应和人的免疫反应是极度不同的。因此，LAL检测不可能完全取代家兔法(Hasiwa,N.,M.Daneshian,andT.Hartung,2013.30(2):169-209.)。随着人们对动物福利问题的日益关注，上述传统的两种热原检测方法对于产品的质量控制正面临严峻的挑战。最近，一种RPT或者LAL的替代方法逐渐发展起来，也就是单核细胞激活检测(MAT)(Wunderlich,C.,S.Schumacher,andM.Kietzmann,BMCPharmacologyandToxicology,2014.)。MAT是基于热原激活人单核细胞和利用酶联免疫吸附实验测量细胞因子的释放，例如IL-1β，IL-6，TNF-α，而且这些细胞因子的释放是与人的发热反应是相似的(Gimenes,I.,etal.RegulToxicolPharmacolm,2015.73(1):356-360.)。目前，尽管单核细胞激活检测法似乎更符合要求：不使用动物，能真实模拟人体对热原的反应，并且能定量或半定量地检测出较多种类的热原物质，操作简便等(Hartung,T.,ALTEX,2015.32(2):79-100.)，但其需要找到合适的细胞，目前研究比较热门的细胞如MM6亚克隆细胞，较难得到，不适合广泛的推广，而THP-1细胞灵敏度较低。因此，利用细胞系法进行热原检测存在许多亟待解决的问题，而寻找新的热原检测方法仍然是迫在眉睫。内毒素是最强有力的细菌细胞因子的诱导子。在感染过程中，热原刺激人的单核细胞去合成或者释放炎症细胞因子，包括IL-1β，IL-6，TNF-α(Cavaillon,J.M.,Toxicon,2017.；J.J.LEE,etal.,JapaneseJournalofPhysiology,2003.53:367-375.；Nakagawa,Y.,H.Maeda,andT.Murai,ClinicalandVaccineImmunology,2002.9(3):588-597.)。而NF-κB又是调控编码促这些炎性细胞因子基因的一个主要的转录因子。而且，已经有证据表明阻止NF-κB的激活也许是治疗发热的有效策略(J.J.LEE,etal.,JapaneseJournalofPhysiology,2003.53:367-375.；Barnes,P.J.andM.Karin,NewEnglandJournalofMedicine,1997.)。与此同时，在正常的家兔体内，人的β-干扰素可以显著性增加这种由内毒素引起的发热反应，它是通过增强TNF依赖的TNF的产生来实现的(Kawasaki,H.,etal.,INFECTIONANDIMMUNITY,1987.55(11):2574-2578.；Kawasaki,H.,etal.,INFECTIONANDIMMUNITY,1989.57(10):3131-3135.；Kawasaki,H.,M.Moriyama,andH.本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法，其特征在于，包括：(1)将NF‑κB或者IFN‑β基因组装到可表达嘌呤霉素的慢病毒表达载体中，构建含有NF‑κB基因的重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒稳定转染到上皮细胞系中；(3)将步骤(2)得到的上皮细胞系使用嘌呤霉素筛选，并用流式分选单克隆细胞；(4)将步骤(3)得到的单克隆细胞使用高剂量的LPS刺激，其中对LPS有反应的则为NF‑κB或者IFN‑β阳性克隆；(5)将步骤(4)得到的阳性克隆使用更低剂量的LPS刺激，得到极灵敏的阳性克隆细胞。

【技术特征摘要】
1.一种可检测热原的单克隆细胞系的制备方法，其特征在于，包括：(1)将NF-κB或者IFN-β基因组装到可表达嘌呤霉素的慢病毒表达载体中，构建含有NF-κB基因的重组质粒；(2)将步骤(1)得到的重组质粒稳定转染到上皮细胞系中；(3)将步骤(2)得到的上皮细胞系使用嘌呤霉素筛选，并用流式分选单克隆细胞；(4)将步骤(3)得到的单克隆细胞使用高剂量的LPS刺激，其中对LPS有反应的则为NF-κB或者IFN-β阳性克隆；(5)将步骤(4)得到的阳性克隆使用更低剂量的LPS刺激，得到极灵敏的阳性克隆细胞。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的NF-κB或者IFN-β基因分别位于pNFκB-luc或者pGL...

【专利技术属性】
技术研发人员：方敏，李凯莉，王滔，徐赫男，姜威，李晶，刘文军，段学锋，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，安徽大学，中国科学院上海生命科学研究院湖州营养与健康产业创新中心，
类型：发明
国别省市：北京,11