能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一株能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株及其应用，该菌株分离自蛇足石杉中的内生真菌，分类命名为Plectosphaerella cucumerina，指定名称为IA2，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.11605，保藏日期为：2015年11月24日。与现有技术相比，本发明专利技术提供的菌株能够高效转化底物4AD特异性生成睾内酯酮(17a‑氧代‑D‑扩环‑雄甾‑1，4‑二烯‑3，17‑二酮)和雄甾‑1,4‑二烯‑3,17‑二酮(ADD)。底物4AD的转化率随着转化时间的增加而显著提高，到第3天4AD转化完全。第3天转化产物ADD的得率达到最高为90％以上，之后逐渐降低；转化产物睾内酯酮的生成率与转化时间呈正相关，到10天达到了静态平衡，经发酵培养后得率达92％以上。

Strain capable of efficiently transforming 4AD to synthesize testosterone ketone and ADD and its application

The present invention relates to a strain which can efficiently transform 4AD into testosterone and ADD and its application. The strain is isolated from endophytic fungi of Huperzia serrata and is classified as Plectosphaerella cucumerina, designated as IA2. It is currently preserved in the General Microbial Center of China Microbial Species Conservation and Management Commission. The preservation number is CGMCC NO.11605, and the preservation date is November 24, 2015. Compared with the prior art, the strain provided by the present invention can efficiently transform substrate 4AD to produce testosterone (17a 1,4_3,17_dione) and androsterone 1,4 The conversion rate of substrate 4AD increased significantly with the increase of conversion time, and the 4AD transformation was complete on the third day. The highest yield of ADD was over 90% on the third day, and then decreased gradually. The yield of testosterone was positively correlated with the time of transformation, and reached a static equilibrium on the 10th day. The yield was over 92% after fermentation.

【技术实现步骤摘要】
能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株及其应用
本专利技术属于生物
，尤其是涉及一株能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株及其应用。
技术介绍
甾体化合物又称类固醇化合物，普遍存在动植物组织内，胆汁酸(cholicacid)、肾上腺皮质激素(adrenalcortexhormone)、甾体皂苷、胆甾醇(cholestero1)、甾体生物碱等属于此类。其化学结构由一个五元环和三个六元环组成，类似环戊烷多氢菲为母核的化合物，如式1所示，A、B、C环为六元环，D环为五元环，甾体类化合物在A/B环稠合处和C/D环稠合处也就是母核的10、13位通常各有一个甲基，A环和B环可能存在部分双键，17位有长短不同的侧链。甾体化合物的这种结构不仅具有很强的生理活性，而且由于其母核上的双键位置、取代基和立体结构的自由变化组合，形成了种类各异的甾体类药物，因此甾体类化合物具有很高的医学价值。式1甾体化合物结构通式具有甾核结构的化合物多为激素类化合物，被广泛用于心血管疾病、淋巴白血病、细菌性脑炎、风湿性关节炎、支气管哮喘、骨质疏松抗肿瘤等疾病。甾体激素类药物可分为五类：1.类皮质激素，如：可的松、强的松、氢化可的松、地塞米松、泼尼松、氟轻松等；2.雌激素，如：乙炔雌二醇、戊酸雌二醇等；3.雄激素，如：睾丸素、甲基睾丸素等；4.蛋白同化激素，如：苯丙酮诺龙、大力补等；5.避孕药，如：炔诺酮、甲地孕酮、乙酸孕酮等。类皮质激素具有抗炎症、抗变态反应性功效，临床上被广泛用于治疗类风湿性关节炎、支气管哮喘及湿疹等皮肤病；性激素是治疗雄性器官衰退和某些妇科疾病的主要药物，是口服避孕药的主要成分；蛋白同化激素用于改善蛋白代谢，恢复和增强体力以及利尿降压等。雄甾烯二酮(雄甾-4-烯-3,17-二酮，Androstenedione)，简称4AD，结构如式2所示，分子式为C19H26O2，外观呈白色晶体粉末装，无毒性，无异味，溶于醋酸、乙醇、乙醚等有机溶剂，是合成众多甾体药物不可或缺的关键中间体，对机体起着非常重要的调节作用。雄甾二烯二酮(雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮)，简称ADD，结构式如式3所示，分子式C19H24O2，来源4AD的脱氢产物。式24AD(雄甾-4-烯-3,17-二酮)化学结构式式3ADD(雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮)化学结构式雄甾酮(Androsterone)发现于1931年，Butenandt等从一名男性警察尿液中分离出一种化合物，并将它命名为雄甾酮。1935年，Ruzicka和Butenandt等报道了从胆固醇合成雄甾烯二酮的研究。一年后，Kochakian发现，雄甾烯二酮具有雄性激素和蛋白同化激素的特性。可以说几乎所有的甾体类药物都可已通过4AD作为原料进行合成，近年来随着甾体类药物的需求不断扩大，采用天然原料薯蓣皂素或剑麻皂素制备甾体类药物，显然不能满足人们日益增长的需求，面对这一难题，国内外学者将微生物转化技术应用于甾体药物中间体雄甾烯二酮(androst-4-ene-3,17-dione，4AD)的制备研究取得了突破性的进展。美国以豆甾醇作原料，经微生物转化获得了制备甾体药物的关键中间体4AD，并以此合成甾体药物，从此不仅解决了国内薯蓣植物有限而造成的原料瓶颈问题，而且大大地降低了制造成本，并减少了环境污染，这是甾体药物领域的一次重大革命。甾体药物近些年取得突飞猛进发展，应归功于筛选到了关键的微生物菌种，能够将谷甾醇、豆甾醇和胆固醇等动植物甾醇转化为关键中间体雄甾烯二酮和雄甾二烯二酮，以及研究开发了能用于大规模工业化生产的转化技术。通过微生物转化得到雄烯二酮和雄甾二烯二酮，并以此合成甾体药物，不仅可以大大简化甾体药物的生产工艺，降低生产成本，提高产品收率和质量，而且能进行综合利用，减少“三废”污染。从已有的信息和资料可以看出，目前世界先进国家，在甾体药物的制备上，大多以动植物甾醇为起始原料进行微生物转化，得到雄烯二酮和雄甾二烯二酮后，再进一步制备一系列相关药物。中国专利CN106282077A公布了一株高效转化植物甾醇的分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1及其应用，该菌株保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCCNo.13031。分枝杆菌(Mycobacteriumsp.)LY-1能转化植物甾醇为9α-羟基雄甾-4-烯-3，17-二酮，在底物投料量为15g/L的条件下，产物得率33％。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一株能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株及其应用。本专利技术提供的菌株以甾体药物关键中间体—雄甾烯二酮(4AD)和雄甾二烯二酮(ADD)为底物，并能够高特异性生物转化获得睾内酯酮。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术提供了一株能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株，该菌株分离自蛇足石杉中的内生真菌，分类命名为Plectosphaerellacucumerina，指定名称为IA2，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.11605，保藏日期为：2015年11月24日。保藏地点为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。本专利技术提供的菌株以甾体药物关键中间体—雄甾烯二酮(4AD)为底物，能够高特异性生物转化获得睾内酯酮。具体而言，该菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮(4AD)为底物，将4AD转化生成睾内酯酮(17a-氧代-D-扩环-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮)；且能高效特异性转化，得率92％以上。或，该菌株以甾体药物关键中间体—雄甾-4-烯-3,17-二酮(4AD)为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)；且能高效特异性转化，得率90％以上。或，该菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮(4AD)为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成宝丹酮。或，该菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮(4AD)为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮(4AD)同时转化生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮(ADD)、睾内酯酮与宝丹酮。本专利技术提供的其中一种菌株转化雄甾-4-烯-3,17-二酮(4AD)的方法如下：1)将IA2菌种接种于种子培养基中，作为一级种子液，进行培养，待真菌菌丝长好后，将一级种子液转接到转化培养基中进行培养，投加雄甾-4-烯-3,17-二酮底物，使最终雄甾-4-烯-3,17-二酮底物的浓度为0.2-0.8g/L(优选为0.5g/L)；2)投加底物5天后，取出菌体发酵液，抽真空离心，收集滤液，萃取，减压旋蒸萃取液，得到粗制产物；3)转化产物的分离：将粗制产物加入氯仿，超声促溶，拌入硅胶粉，搅拌均匀，常温条件下风干，得到预分离物，将预分离物加入硅胶柱中，用二氯甲烷、乙酸乙酯两种有机溶剂进行梯度洗脱，分部收集；用TLC检测收集洗脱液，将含有相同组分的各流份合并，并减压浓缩，依次得到硅胶柱分离后的各个区段粗品，再经硅胶柱和HPLC分离，最终得到不同转化产物。HPLC分离时，5.021min、11.248min和16.805min三个转化产物分别为睾内酯酮、雄甾-1,4-二烯-3，17-二酮和宝丹酮。本本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一株能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株，其特征在于，该菌株分离自蛇足石杉中的内生真菌，分类命名为Plectosphaerella cucumerina，指定名称为IA2，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.11605，保藏日期为：2015年11月24日。

【技术特征摘要】
1.一株能够高效转化4AD特异性合成睾内酯酮和ADD的菌株，其特征在于，该菌株分离自蛇足石杉中的内生真菌，分类命名为Plectosphaerellacucumerina，指定名称为IA2，目前保存在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCCNO.11605，保藏日期为：2015年11月24日。2.如权利要求1所述的菌株应用，其特征在于，该菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成17a-氧代-D-扩环-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮。3.根据权利要求2所述的菌株应用，其特征在于，菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成17a-氧代-D-扩环-雄甾-1，4-二烯-3，17-二酮，能高效特异性转化，得率92％以上。4.如权利要求1所述的菌株应用，其特征在于，该菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮。5.根据权利要求4所述的菌株应用，其特征在于，菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮，能高效特异性转化，得率90％以上。6.如权利要求1所述的菌株应用，其特征在于，该菌株以雄甾-4-烯-3,17-二酮为底物，将雄甾-4-烯-3,17-二酮转化生成宝丹酮。7.如权利要求1所述的菌株应用，其特征在于，该菌株以雄甾-...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵军，吴江华，牛诗佳，刘巧玲，朱砚姝，
申请(专利权)人：上海师范大学，
类型：发明
国别省市：上海,31