Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用技术

本发明专利技术属于生物工程领域，尤其涉及一种Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用。所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。本发明专利技术在PGBTNH2载体中连入的目的基因Sep15的C端的his‑tag标签不会表达，从而使酶切后Sep15能与带有his‑tag标签的GB‑1分离，即通过该表达载体进行转化、培养、酶切等步骤即可分离出较纯的Sep15蛋白。

【技术实现步骤摘要】
Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用
本专利技术属于生物工程
，具体涉及一种Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用。
技术介绍
Sep15蛋白是一种硒蛋白，其分子质量为15KDa；Sep15蛋白跟多种疾病相关。在现有的研究和专利中，有大量的硒蛋白体内实验和阿尔兹海默病的研究，但并无Sep15蛋白重组表达以及在体外实验的研究，也无其对TauR2(一种Tau蛋白，含量最高的微管蛋白)、Abeta(又称Aβ，一种淀粉样多肽)聚集的影响的研究。Tau蛋白或Abeta的聚集同AD的相关性更高。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的上述不足，提供一种Sep15蛋白的表达载体、纯化方法及其应用，旨在解决现有技术Sep15蛋白表达载体及其纯化技术有限的问题。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下：本专利技术一方面提供一种Sep15蛋白的表达载体，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。本专利技术另一方面提供一种Sep15蛋白的纯化方法，包括如下步骤：将本专利技术上述的表达载体转入大肠杆菌中，得到转化菌种；将所述转化菌种进行诱导培养后，得到培养菌液；将所述培养菌液超声处理，然后离心分离得到上清液；将所述上清液进行酶切处理，然后层析分离得到所述Sep15蛋白。本专利技术最后还提供一种上述表达载体在Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应的检测中的应用。本专利技术提供的Sep15蛋白的表达载体基于重组构建PGBTNH2载体得到，PGBTNH2载体上含有GB-1助溶标签，C端及N端均含有his-tag标签，而在PGBTNH2载体中连入的目的基因Sep15含有终止密码，所以其C端的his-tag标签不会表达，从而使酶切后Sep15能与带有his-tag标签的GB-1分离，即通过该表达载体进行转化、培养、酶切等步骤即可分离出较纯的Sep15蛋白。同时，通过研究证明Sep15蛋白可以抑制Tau蛋白以及Abeta的聚集反应，因此本专利技术的Sep15蛋白的表达载体可用于检测Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应。附图说明图1为本专利技术实施例1中PGBTNH2质粒载体图谱：图2为本专利技术实施例1中亲和层析柱纯化重组蛋白结果检测图；图3为本专利技术实施例1中纯化后SDS-PAGE电泳结果图(酶切前)；图4为本专利技术实施例1中BSA法蛋白浓度定量标准曲线图(酶切前)；图5为本专利技术实施例1中酶切鉴定电泳结果图；图6为本专利技术实施例1中镍柱亲和层析过柱结果图(酶切后)图7为本专利技术实施例1中纯化后SDS-PAGE电泳结果图(酶切后)；图8为本专利技术实施例1中第二次蛋白浓度测定标准曲线图；图9为本专利技术实施例1中胶内酶切后质谱鉴定结果图；图10为本专利技术实施例2中TauR2聚集实验结果图；图11为本专利技术实施例3中Abeta1-42聚集实验结果图；图12为本专利技术实施例3含有其他蛋白的Abeta1-42聚集实验结果图。具体实施方式为了使本专利技术要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。一方面，本专利技术实施例提供了一种Sep15蛋白的表达载体，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。PGBTNH2质粒信息如图1所示；目的基因Sep15插入位置是载体图中MCS(多克隆位点)。本专利技术实施例提供的Sep15蛋白的表达载体通过重组构建PGBTNH2载体得到，PGBTNH2质粒上含有GB-1助溶标签，C端及N端均含有his-tag标签，又在载体中连入的目的基因Sep15(含有终止密码)，所以其C端的his-tag标签不会表达，从而使酶切后Sep15能与带有his-tag标签的GB-1分离。与PGBTNH载体相比较，PGBTNH2载体能排除多克隆位点BamHⅠ和EcoRⅠ之间的84bp多余片段的影响因素，且通过亲和层析Sep15蛋白能与GB-1分开，即分离出较纯的Sep15。另一方面，本专利技术实施例还一种Sep15蛋白的纯化方法，包括如下步骤：S01：将上述表达载体转入大肠杆菌中，得到转化菌种；S02：将所述转化菌种进行诱导培养后，得到培养菌液；S03：将所述培养菌液超声处理，然后离心分离得到上清液；S04：将所述上清液进行酶切处理，然后层析分离得到所述Sep15蛋白。本专利技术实施例的纯化方法使用了本专利技术实施例提特有的Sep15蛋白的表达载体，该表达载体表达酶切后Sep15蛋白能与带有his-tag标签的GB-1分离，即通过该表达载体进行转化、培养、酶切等步骤即可分离出较纯的Sep15蛋白。纯化出的Sep15蛋白可用于体外实验，便于研究Sep15蛋白的功能及应用。进一步地，上述步骤S02中，所述诱导培养的步骤包括：将所述转化菌种进行摇床扩摇培养至OD值为0.6-0.8，然后加入诱导剂，再进行摇床诱导培养。该OD值表明：此时为大肠杆菌的对数生长期，更适用于诱导表达。更进一步地，所述摇床扩摇培养的条件包括：35-37℃恒温摇床3-4h；优选为：220rpm、37℃恒温摇床中摇菌3.5h。所述摇床诱导培养的条件包括：15-16℃恒温摇床12-24h。优选为：置于16℃条件下，220rpm摇床中摇菌12h。优选地，所述诱导剂为IPTG(异丙基硫代半乳糖苷)。进一步地，上述步骤S03中，所述超声处理的条件包括：4-6℃超声25-30min；可优选30min，即将菌液倒入烧杯中，可置于冰上，超声30min；该条件下的破碎效果最佳，可得到更多的含有Sep15蛋白的重组蛋白。所述离心处理的条件包括：7000-8000rpm离心25-30min。优选为：在4℃条件下，8000rpm离心30min至上清液澄清。更优选地，为得到更多的目标蛋白，在超声处理之前，可培养菌液置于预冷后的离心机中，4℃，8000rpm，离心15min；然后弃上清液，用balancebuffer(具体成分见下述说明书中)将沉淀重悬。进一步地，上述步骤S04中，所述酶切处理的步骤包括：按照4U/ml的比例向所述上清液中加入凝血酶，酶切40-48h。优选地，于室温中酶切48h。进一步地，上述步骤S04中，所述层析分离为镍柱亲和层析分离。所述镍柱亲和层析分离的步骤包括：用50mmol/L、100mmol/L、200mmol/L、300mmol/L的咪唑浓度梯度溶液进行梯度洗脱。通过梯度洗脱，可得到更纯的Sep15蛋白。最后，本专利技术实施例还提供一种上述本专利技术的Sep15蛋白的表达载体在Tau蛋白和/或Abeta的聚集反应的检测中的应用。在该应用中，所述检测的方法优选为ThT(硫磺素-T，一种阳离子荧光试剂)荧光光谱法。本专利技术实施例初次在体外检测出Sep15蛋白具有抑制Tau蛋白(优选为TauR2蛋白)、Abeta(优选为Abeta1-42)聚集的作用，如此，可对后续Sep15蛋白与Tau、Abeta相关病理的研究提供思路。本专利技术先后进行过多次试验，现举一部分试验结果作为参考对专利技术进行进一步详细描述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种Sep15蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种Sep15蛋白的表达载体，其特征在于，所述表达载体包括PGBTNH2质粒以及连入所述PGBTNH2质粒中的目的基因Sep15，且所述目的基因Sep15中的硒代半胱氨酸位点突变为硫代半胱氨酸。2.一种Sep15蛋白的纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1所述的表达载体转入大肠杆菌中，得到转化菌种；将所述转化菌种进行诱导培养后，得到培养菌液；将所述培养菌液超声处理，然后离心分离得到上清液；将所述上清液进行酶切处理，然后层析分离得到所述Sep15蛋白。3.如权利要求2所述的纯化方法，其特征在于，所述诱导培养的步骤包括：将所述转化菌种进行摇床扩摇培养至OD值为0.6-0.8，然后加入诱导剂，再进行摇床诱导培养。4.如权利要求3所述的纯化方法，其特征在于，所述摇床扩摇培养的条件包括：35-37℃恒温摇床3-4h；和/或所述摇床诱导培养的条件包括...

【专利技术属性】
技术研发人员：田静，王恒，任冰玉，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44