本发明专利技术涉及生物技术领域，具体公开了一种利用碱性标签和内含肽(Intein)融合表达纯化重组蛋白的方法及其应用。所述方法将所要研究的目的蛋白与具有自剪接功能的Intein以及碱性标签融合表达，可通过离子交换层析快速实现目的蛋白的纯化。与传统方法相比，本发明专利技术所述方法可省却外源性酶的应用，并且离子交换成本较低，对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物
，具体公开了一种利用碱性标签和内含肽融合表达纯化 重组蛋白的方法及其应用。
技术介绍
酶、蛋白、抗体等重组蛋白类产品在人们的生产、生活、医疗中发挥着不可或缺的 作用。尤其是重组蛋白、单克隆抗体等生物技术药物是20世纪后期随着生命科学的发展而 出现的最新一代药物，具有高效、低毒、生物功能明确等一系列优势，连续6年的全球销售 额增长率保持在15%~33%，已成为我国的战略支柱产业。 然而重组蛋白在表达和纯化工艺上还存在相当大的技术困难，远未达到满足人们 需求的程度。为达到增加表达量，提高产物的正确构象及可溶性，方便下游纯化操作，人们 可采用亲和标签融合表达的方式，应用如麦芽糖结合蛋白MBP，谷胱甘肽硫转移酶GST，多 聚组氨酸6Hi s等。这些亲和表达策略大大促进了蛋白的研究和应用，但面临两个主要的问 题，一是亲和纯化介质的成本较高；二是为保持目的蛋白的结构、功能等特性，必须采取一 定的方法将标签去除。目前去除标签最常用的是酶切方法，包括激酶，Xa因子等，但酶的应 用存在成本高，酶切效率低下以及后续酶本身的去除等问题，难以实现大规模的工业生产。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种表达纯化目的蛋白的方法，用 于解决现有技术中的问题。所述方法将所要研究的目的蛋白与具有自剪接功能的内含肽 (Intein)以及碱性标签融合表达，可通过离子交换层析快速实现目的蛋白的纯化。与传统 方法相比，本专利技术所述方法可省却外源性酶的应用，并且离子交换层析与亲和层析相比成 本较低，对于放大规模的工业生产具有很好的应用前景。 本专利技术是通过以下技术方案实现的： 本专利技术的第一方面公开了一种表达纯化目的蛋白的方法，所述方法具体包括如下 步骤： (1)构建目的蛋白表达载体：将目的蛋白编码基因序列与具有自剪接功能的 Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列融合后获得目的蛋白表达单元，并将所述 目的蛋白表达单元插入表达质粒上，构建获得目的蛋白表达载体； (2)将步骤⑴中所得目的蛋白表达载体转化宿主系统，获得转化的宿主，并在表 达条件下，培养转化的宿主，从而表达由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白； (3)去除不溶性物质并采用离子交换层析法分离由目的蛋白、碱性标签、Intein 组成的融合蛋白； (4)将步骤（3)所得融合蛋白在适当的条件下孵育，进行切割，将目的蛋白从融合 蛋白中释放到溶液中； (5)分离目的蛋白和碱性标签：将步骤（4)中所得溶液进行离子交换层析，洗脱得 到目的蛋白。 优选的，步骤（1)中，所述碱性标签为pl>7的超碱性蛋白或多肽，包括但不限于 Zbasic，Zbasic2〇 更优选的，所述碱性标签为Zbasic，所述Zbasic的编码基因序列如SEQ ID NO. 1 所示，具体为： GTTGATAACAAATTTAACAAAGAACGTCGCCGTGCTCGTCGTGAAATCCGTCATCTGCCGAATCTGA ATCGTGAACAGCGTCGTGCGTTTATTCGTAGCCTGCGCGATGACCCGTCACAAAGCGCAAACCTGCTGGCTGAAG CGAAAAAACTGAACGATGCCCAACCGAAA 〇 优选的，所述Intein包括具有自剪接或自我断裂功能的已知各类Intein的顺式 及反式剪接形式。 更优选的，所述Intein为来源于Mtu RecA intein的Δ I-CM，所述Δ I-CM的编码 基因序列如SEQ ID N0. 2所示，具体为： GCCCTCGCAGAGGGCACTCGGATCTTCGATCCGGTCACCGGTACAACGCATCGCATCGAGGATGTTGTC GgtGGGCGCAAGCCTATTCATGTCGTGGCTGCTGCCAAGGACGGAACGCTGCATGCGCGGCCCGTGGTGTCCTGGTT CGACCAGGGAACGCGGGATGTGATCGGGTTGCGGATCGCCGGTGGCGCCATCctgtgGGCGACACCCGATCACAAGG TGCTGACAGAGTACGGCTGGCGTGCCGCCGGGGAACTCCGCAAGGGAGACAGGGTGGCGCAACCGCGACGCTTCGAT GGATTCGGTGACAGTGCGCCGATTCCGGCGCGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGA CATGCTGGCGGAAGAACTCCGCTATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCG AGGTCGAGGAACTGCACACCCTCGTCGCCGAAGGGGTTGTCGTGCACAAC〇 优选的，步骤（1)中，所述目的蛋白表达单元的序列还包括以下特征中的任一项： a)所述目的蛋白表达单元的序列含有从N端到C端依次排列的碱性标签编码基因 序列、Intein编码基因序列以及目的蛋白编码基因序列； b)所述目的蛋白表达单元的序列含有从N端到C端依次排列的目的蛋白编码基因 序列、Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列； c)所述目的蛋白表达单元的序列含有两个阅读框，分别是断裂Intein的N端部 分，即Int (N);从N端到C端依次排列的碱性标签编码基因序列、断裂Intein的C端部分 即Int(C)编码基因序列以及目的蛋白编码基因序列。 优选的，所述碱性标签编码基因序列与Intein编码基因序列之间可以直接连接， 也可以采用GGGGS或GGSG及其重复等柔性肽端连接。 优选的，步骤（1)中，所述目的蛋白表达单元的序列还包括两端的酶切位点序列。 优选的，步骤（1)中，所述表达质粒为适用于原核或真核表达系统的质粒。 更优选的，所述表达质粒为采用 T7、lac、tac、araBAD、FLDl、AOXl、GAP、CMV、El α 等启动子的适用于原核或真核表达系统的质粒。 最优选的，所述表达质粒为pET30a。 在本专利技术的一个较优实施例中，所述目的蛋白表达序列插入到pET30a原核表达 载体的限制性酶切位点之间。更优的，所述目的蛋白表达单元序列插入到pET30a原核表达 载体的Nde I酶和Xho I酶的限制性酶切位点之间。 较优的，步骤（1)具体为将目的蛋白表达单元通过酶切、连接的方法插入pET30a 原核表达载体，连接产物转化ToplO感受态细胞，筛选正确连接的载体作为构建成功的目 的蛋白表达载体。 所述筛选为采用添加有卡那霉素（Kana)的LB培养基选择培养转化了连接产物的 感受态细胞，挑取单克隆进行测序分析，验证连接产物正确连入了 pET30a原核表达载体。 优选的，步骤（1)中所述目的蛋白为白介素-15,所述白介素-15的编码基因序列 如SEQ ID N0. 3所示，具体为： CGCGTGCAGGCGCTCGCGGATGCCCTGGATGACAAATTCCTGCACGACATGCTGGCGGAAGAACTCCGC TATTCCGTGATCCGAGAAGTGCTGCCAACGCGGCGGGCACGAACGTTCGGCCTCGAG本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种表达纯化目的蛋白的方法，所述方法具体包括如下步骤：(1)构建目的蛋白表达载体：将目的蛋白编码基因序列与具有自剪接功能的Intein编码基因序列以及碱性标签编码基因序列融合后获得目的蛋白表达单元，并将所述目的蛋白表达单元插入表达质粒上，构建获得目的蛋白表达载体；(2)将步骤(1)中所得目的蛋白表达载体转化宿主系统，获得转化的宿主，并在表达条件下，培养转化的宿主，从而表达由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白；(3)去除不溶性物质并采用离子交换层析法分离由目的蛋白、碱性标签、Intein组成的融合蛋白；(4)将步骤(3)所得融合蛋白在适当的条件下孵育，进行切割，将目的蛋白从融合蛋白中释放到溶液中；(5)分离目的蛋白和碱性标签：将步骤(4)中所得溶液进行离子交换层析及后续精制纯化步骤，洗脱得到目的蛋白。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：路慧丽，朱建伟，张蕾，江华，谢跃庆，史斯玮，丁凯，陈俊升，韩雷，李宁环，
申请(专利权)人：上海交通大学，杰科实验室，
类型：发明
国别省市：上海;31
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